microRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)節(jié)作用*

王俊成 劉洪臣

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群，在不同的誘導(dǎo)條件下,能夠向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化[1],對(duì)于細(xì)胞治療和組織再生具有重要的臨床應(yīng)用潛力。MSCs成骨分化過程受到遺傳和表觀遺傳機(jī)制調(diào)控，但其具體分子機(jī)制仍不明確。因此，揭示MSCs成骨分化的分子機(jī)制是其臨床應(yīng)用的重要前提。目前有研究表明一類小分子非編碼RNA——microRNA(miRNA)在MSCs的成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用，本文就其對(duì)MSCs成骨分化調(diào)控作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1.miRNA的概念和功能

miRNA是一類廣泛存在于各類生物體中的、長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因mRNA的堿基配對(duì)導(dǎo)致其降解或翻譯阻遏，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)與個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，其參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，人類基因中編碼miRNA的基因大約占總基因群的3%，然而這些少量的miRNA卻調(diào)控著40%－90%的人類蛋白編碼基因[5]。目前在已在胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多能間充質(zhì)干細(xì)胞，并在這些干細(xì)胞的分化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量miRNA的存在，并且研究證明他們與干細(xì)胞的自我更新和分化密切相關(guān)，在調(diào)控干細(xì)胞活性方面也扮演著重要角色[6]。

成熟的miRNA與Dicer酶以及一些相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex RISC)[7]，也稱為miRNA核蛋白復(fù)合物(miRNP)[8]，對(duì)基因的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用。miRNA與靶基因mRNA的作用方式有兩種：當(dāng)兩者完全互補(bǔ)時(shí)，它們可以直接裂解mRNA，通過脫腺苷化導(dǎo)致mRNA降解；而當(dāng)miRNA與mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，miRNA則通過與mRNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，阻遏轉(zhuǎn)錄后翻譯。由于許多動(dòng)物中miRNA與靶基因mRNA并不完全互補(bǔ)，所以主要的作用模式是轉(zhuǎn)錄后的翻譯抑制。成熟miNA 5’端(2-7或2-8個(gè)核苷酸)被稱為“種子區(qū)”[5]，該區(qū)對(duì)于miRNA結(jié)合目的mRNA3’端的互補(bǔ)序列非常重要。用計(jì)算機(jī)及實(shí)驗(yàn)方法對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)也是通過設(shè)計(jì)與miRNA3’端種子區(qū)互補(bǔ)的保守序列來(lái)進(jìn)行的。通過這些復(fù)雜的生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的一個(gè)miRNA的靶基因往往就有幾百個(gè)，因此靶基因的預(yù)測(cè)還需要一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，這也提示一個(gè)miRNA可能調(diào)控著多個(gè)mRNA的翻譯。

目前，關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)靶基因的報(bào)道還不多，這種基因控制的類型代表著一種新的調(diào)控機(jī)制，并且被認(rèn)為是能夠影響包括發(fā)育程序在內(nèi)許多關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程。研究miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)的難點(diǎn)是預(yù)測(cè)和驗(yàn)證特定miRNA作用的靶基因mRNA。目前結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)主要是通過計(jì)算機(jī)。并且，miRNA及其靶基因mRNA序列在物種之間具有保守性，這也有助于對(duì)未知miRNA的預(yù)測(cè)。目前對(duì)于驗(yàn)證靶基因的方法最直接的是使用具有可替換3′端非編碼區(qū)的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)[9]。

2.miRNA對(duì)MSCs成骨分化的調(diào)控

間充質(zhì)干細(xì)胞從開始定向分化到最終分化為成骨細(xì)胞受到基因表達(dá)的精確調(diào)控。敲除Dicer和Drosha酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)所有miRNA生成障礙后,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力喪失[10]。而體內(nèi)敲除Dicer酶后導(dǎo)致小鼠肢體發(fā)育障礙[11]，提示適當(dāng)水平miRNA表達(dá)對(duì)于干細(xì)胞成骨分化是必不可少的。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MSCs向成骨細(xì)胞分化是個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控，如TGFβ信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，Runx/osteorix信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等[12]。miRNA是骨形成基因的重要的調(diào)節(jié)因子，它能夠通過對(duì)靶基因mRNA的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)節(jié)骨形成過程中各種信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子以及它們的受體。通過對(duì)這些信號(hào)通路中的不同水平的關(guān)鍵分子的調(diào)節(jié)作用構(gòu)成了干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而達(dá)到對(duì)干細(xì)胞成骨的精確調(diào)控。通常來(lái)講，miRNA對(duì)基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，因此miRNA對(duì)成骨的作用可能是通過作用于促進(jìn)成骨的基因而抑制成骨，或者是作用于抑制成骨作用的基因，從而間接的對(duì)成骨進(jìn)行正性調(diào)控?，F(xiàn)將在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起關(guān)鍵作用的miRNA進(jìn)行總結(jié)。

3.抑制成骨分化的miRNA

Mizuno等[13]發(fā)現(xiàn)miR-125b在小鼠ST2細(xì)胞分化的早期階段通過抑制細(xì)胞的增殖從而抑制其成骨分化。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)同它抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖作用一樣，也是通過抑制成骨分化過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的ErbB2基因發(fā)揮作用的。

Itoh等[14]發(fā)現(xiàn)miR-141和-200a能夠顯著下調(diào)BMP-2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的分化。其作用可能是通過抑制Dlx5基因的翻譯發(fā)揮作用的。隨后，Hassan等[15]又發(fā)現(xiàn)在MC3T3-E1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子Runx2能夠降低一組基因miR～23a～27a～24-2的表達(dá)，而這些miRNA會(huì)對(duì)SATB2基因產(chǎn)生抑制作用，SATB2是骨形成的激活劑。因此，就建立了一個(gè)Runx2通過抑制miR-23a～27a～24-2而使得SATB2的抑制得到釋放的前反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。另外，他們還發(fā)現(xiàn)在成骨分化的終末階段miR-23a能夠反過來(lái)結(jié)合到Runx2的3′端非編碼區(qū)，直接抑制Runx2的表達(dá)，通過該反饋機(jī)制從而減緩骨細(xì)胞的成熟。

Li[16]在BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞成骨分化中，發(fā)現(xiàn)在25個(gè)顯著改變的miRNA中有22個(gè)是下調(diào)的。他們選擇其中兩個(gè)有代表性的miR-133和miR-135進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)miR-133直接作用于Runx2，而miR-135作用于Smad5，二者協(xié)同抑制骨形成。這些研究為臨床上通過抑制miR-133和miR-135從而達(dá)到增加間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨系細(xì)胞的能力最終重建骨組織提供了理論依據(jù)。Inose等[17]也發(fā)現(xiàn)，以前被認(rèn)為是肌肉組織特有的miR-206也是成骨分化過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在C2C12細(xì)胞分化過程中，miR-206在成骨細(xì)胞中表達(dá)，并隨著成骨分化的進(jìn)行其表達(dá)是逐漸降低的。如果過表達(dá)，miR-206會(huì)抑制成骨分化，相反敲除miR-206則會(huì)促進(jìn)成骨分化作用。其靶基因是連接蛋白43(Cx43)—成骨細(xì)胞中一種主要的間隙連接蛋白。但是，他們也認(rèn)為miR-206可能不僅僅依靠Cx43發(fā)揮作用，成骨分化過程中的多種調(diào)節(jié)因子，例如Runx2和Osterix也參與了miR-206的調(diào)節(jié)。事實(shí)上在miR-206上游序列中有許多這些因子公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)。

最近，在人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSC)成骨分化中發(fā)揮作用的miRNA也陸續(xù)被報(bào)道。Eskildsen等[18]發(fā)現(xiàn)miR-138能夠抑制人的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。并且體內(nèi)試驗(yàn)中過表達(dá)miRNA-138能夠使得異位骨形成能力下降85%；相反，當(dāng)miR-138作用被拮抗后，骨形成會(huì)被增強(qiáng)60%。miR-138的靶基因是成簇黏附激酶(FAK)，miR-138通過抑制FAK，從而抑制FAK-ERK1/2信號(hào)通路，結(jié)果使得下游的Runx2和OSX的磷酸化作用降低最終抑制骨分化。Tome等[19]研究miR-335在hMSC分化過程中的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-335能夠抑制hMSCs的增殖和移動(dòng)，以及成骨和成脂的能力。而經(jīng)典Wnt信號(hào)通路能夠上調(diào)、IFN-γ能夠下調(diào)miR-335的表達(dá)。miR-335在hMSC中可能有62個(gè)推測(cè)靶基因，其中RUNX2是其直接的靶基因。Gao等[20]從四個(gè)志愿者身上通過分離和培養(yǎng)hMSCs，并且進(jìn)行成骨分化，通過分化前后miRNA表達(dá)變化的對(duì)比發(fā)現(xiàn)了四個(gè)低表達(dá)的miRNA： hsa-miR-31、 hsa-miR-106a、 hsamiR-148a，并且認(rèn)為這些miRNAs可能作用于RUNX2，CBFB 和 BMPs。Schaap-Oziemlak[21]發(fā)現(xiàn)了hsa-miR-135b在無(wú)限成體干細(xì)胞(USSCs)骨形成中顯著下調(diào)。兩個(gè)成骨標(biāo)志性基因IBSP和Osterix可能是其作用的靶基因。

Huang等[22]研究比較了各種間充質(zhì)祖細(xì)胞和骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(包括 ST2，C2C12，C3H-10T1/2，hMSCs以及取自10周小鼠長(zhǎng)骨的骨髓基質(zhì)細(xì)胞)中miR-204的作用，他們發(fā)現(xiàn)miR-204及其同系物miR-211在這兩種細(xì)胞中作為內(nèi)源性負(fù)性調(diào)節(jié)物存在，他們的作用位點(diǎn)是Runx2的3′端非編碼區(qū)，miR-204的過表達(dá)能夠抑制成骨作用增強(qiáng)成脂肪作用。

4.促進(jìn)成骨分化的miRNA

Li等[23]發(fā)現(xiàn)了在ST2細(xì)胞中miR-2861通過作用一個(gè)促進(jìn)Runx2降解的增強(qiáng)子-組蛋白脫乙?；?histone deacetylase 5，HDAC5)，從而促進(jìn)了BMP2介導(dǎo)的成骨細(xì)胞形成。并且，miR-2861在人類中具有保守性,他們?cè)趦蓚€(gè)相關(guān)的青少年患者中發(fā)現(xiàn)，pre-miR-2861純合子的突變會(huì)阻斷miR-2861的表達(dá)并且導(dǎo)致了原發(fā)性骨質(zhì)疏松。最近，他們又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)miR-3960，該基因與miR-2861位于同一基因座，同miR-2861一樣，也能調(diào)節(jié)BMP2介導(dǎo)的ST2細(xì)胞的骨形成[24]。miR-3960的靶基因是Hoxa2-Runx2表達(dá)的抑制物。反過來(lái)，Runx2的過表達(dá)也會(huì)誘導(dǎo)miR-2861和miR-3960的轉(zhuǎn)錄。因此，他們認(rèn)為在Runx2與miR-2861和miR-3960之間存在一個(gè)獨(dú)特的自我調(diào)節(jié)的反饋回路。

Li等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-29b是MC3T3細(xì)胞骨分化正性調(diào)節(jié)因子,其靶基因是HDAC4、TGFβ3、ACVR2A(activin A receptor type IIA)，通過熒光酶素分析發(fā)現(xiàn)CTNNBIP1和DUSP2也是其靶基因，這些因子在骨分化的過程中發(fā)揮抑制作用。其對(duì)Runx2也有部分的控制。另外，miR-29b還作用于膠原基因Col1a1、Col5a3、Col4a2，在成熟的成骨細(xì)胞中對(duì)膠原合成具有抑制作用以維持已分化的表型。

Schoolmeesters等[26]通過miRNA的抑制因子來(lái)評(píng)價(jià)miRNA在hMSCs早期骨分化中的作用。他們發(fā)現(xiàn)miR-148b,-27a和-489都是調(diào)節(jié)骨形成所必需的，其中miR-489,-27a上調(diào)骨分化，而miR-148b則下調(diào)骨分化。并且，miR-148b,-27a可能是通過抑制粒鈣蛋白(GCA)而發(fā)揮其抑制作用的。He等[27]研究hMSCs中miR-20b的作用，發(fā)現(xiàn)miR-20b通過抑制PPARγ，Bambi和Crim1來(lái)激活BMPs/Runx2信號(hào)通路。其中PPARγ是MSC分化過程中最重要的細(xì)胞命運(yùn)決定因子，它能通過抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄以及下調(diào)BMPs表達(dá)促進(jìn)成脂分化，抑制成骨分化。Bambi是BMP的偽受體，而Crim1則是細(xì)胞表面對(duì)BMP起限制作用的因子。

總之，在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的過程中，存在著許多起調(diào)節(jié)作用的miRNA，這些miRNA組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)細(xì)胞的成骨分化起著精細(xì)的調(diào)節(jié)作用。

5.環(huán)境因素對(duì)miRNA的影響

最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)微環(huán)境的變化非常敏感，當(dāng)環(huán)境變化時(shí)miRNA的功能也會(huì)隨之發(fā)生改變。劉亞麗等[28]研究牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞在炎癥或正常不同環(huán)境中的成骨分化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，miRNA-17在不同的環(huán)境中能夠起到抑制或促進(jìn)兩種完全不同的作用。Zhou等[29]用伊班磷酸鹽處理牙周膜干細(xì)胞改變其生長(zhǎng)的微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)miR-18a, miR-133a，miR-141和miR-19a顯著變化,同時(shí)細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)以及ALP、COL-1、OPG、OCN和Runx2基因的表達(dá)增強(qiáng)。他們認(rèn)為正是通過這些miRNA的表達(dá)的改變，調(diào)節(jié)了下游多個(gè)骨形成相關(guān)基因的表達(dá)。微環(huán)境的異常可能會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞功能的改變從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[30]，而此時(shí)往往伴隨著一些關(guān)鍵miRNA表達(dá)的變化。干細(xì)胞受環(huán)境影響而出現(xiàn)的功能改變是否與異常環(huán)境下miRNA的變化相關(guān)？目前這方面的機(jī)制還不清楚。

糖尿病(diebetes mellitus，DM)常常引起繼發(fā)性骨量減少及骨質(zhì)疏松等，患者頜骨往往表現(xiàn)出相關(guān)變化，如牙槽骨喪失及頜骨的骨質(zhì)疏松[31]，從而引起牙齒的松動(dòng)甚至脫落。目前糖尿病患者牙槽骨容易喪失的具體分子機(jī)制還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境能引起動(dòng)物骨量減少[32]，并且在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力會(huì)受到抑制[33]，這個(gè)過程中與成骨分化相關(guān)的miRNA會(huì)發(fā)生怎樣的變化，miRNA的變化又是怎樣調(diào)控高糖環(huán)境下間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，目前這些方面均未見詳細(xì)報(bào)道。而研究異常狀態(tài)下miRNA對(duì)干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制也必將成為今后研究的熱點(diǎn)。

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