干細胞用于皮膚組織再生及年輕化的研究進展

常毅 綜述 楊松林 審校

干細胞用于皮膚組織再生及年輕化的研究進展

常毅 綜述 楊松林 審校

干細胞具有自我更新、自我復制的能力，有望運用于醫(yī)學發(fā)展的各個領(lǐng)域，包括皮膚損傷的再生。年輕化作為皮膚組織再生的另一種形式，干細胞同樣有可能在該領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。本文就干細胞用于皮膚組織再生及年輕化的研究進展進行綜述。

干細胞 年輕化 皮膚 細胞重編程

生物體的組織、器官中存在一定數(shù)量的干細胞，以維持其再生或者參與損傷后的組織修復。干細胞是一類具有多向分化潛能和自我更新特點的增殖速度緩慢的原始細胞，可以廣泛運用于醫(yī)學發(fā)展的各個領(lǐng)域，皮膚損傷的治療、組織再生及年輕化就是其中的一個部分。

1 干細胞的定義、分類及研究現(xiàn)狀

根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細胞又可以分為胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ES細胞）和成體干細胞（Adult stem cell）。胚胎干細胞是從動物早期發(fā)育的胚胎內(nèi)細胞團（Inner Cell Mass，ICM）或原始生殖細胞（Primordial Germ Cell，PGC）分離得到的一種未分化的永久性細胞系（Embryonic Germ，EG）[1]。

Evans和Kaufman及Martin（1981）分別建立了一種分離多能干細胞的方法，首次獲得ES細胞，當時稱為EK細胞，之后稱為胚胎細胞[1-2]；1983年，Axeirod用微滴法將小鼠晚期囊胚直接培養(yǎng)于STO飼養(yǎng)層（一種成系的小鼠胎兒成纖維細胞培養(yǎng)層）上，獲得了 ES細胞系[3]；1984年,Wobus等[4]首次用原代小鼠胎兒成纖維細胞（Primary Mouse Embryonic Fibroblast，PMEF）飼養(yǎng)層培養(yǎng) ES細胞，并建立了ES細胞系；1987年，Handyside等嘗試建立羊的ES細胞系，但未成功[5]。隨后，先后在倉鼠、豬、牛、羊、兔、水貂等動物上獲得了ES細胞后成功地進行了冷凍和解凍[6]；Shamblott等[7]用5～9周齡胎兒PGC分離克隆出人類ES細胞，經(jīng)體外分化實驗證明，該細胞具有多能性。近年來，對于干細胞的研究有了積極的進步，在醫(yī)學領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應用前景，在皮膚再生醫(yī)學和皮膚年輕化方面同樣可得到廣泛地應用。

1.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞在含10%FBS和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）的 D-MEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)、不需要飼養(yǎng)細胞就能維持非分化狀態(tài)，而改用含有胚胎營養(yǎng)因子（Embryotrophic factor，ETFs）培養(yǎng)5 d時，就可以向類白色脂肪細胞和褐色脂肪細胞分化，該結(jié)果提示，ES細胞可用于皮膚再生和創(chuàng)面愈合治療方面的研究[8]。但是，ES細胞的研究目前存在倫理問題，故對ES細胞的研究和使用均保持著審慎的態(tài)度。

1.2 皮膚干細胞

目前尚未清楚干細胞以未分化狀態(tài)存在的確切機制，但肯定與其周圍微環(huán)境有關(guān)，其中成纖維細胞等間質(zhì)起源的信號機制可能在其中發(fā)揮重要作用。缺乏完全特異的干細胞標記物可能是干細胞的特征之一，是目前難以大量獲取干細胞和臨床治療應用的重要原因[9]。利用抗原特異性-流式細胞技術(shù)，以及干細胞與基質(zhì)高黏附、慢生長特性可以進行干細胞分離、培養(yǎng)和純化。目前公認的表皮干細胞標記物包括細胞角蛋白-15（K15）、K19、β1-整合素和 p53 異構(gòu)體-p63 蛋白等[10]。有研究顯示，使用β1-整合素和α6-整合素抗體進行細胞分離，可獲得高純度的干細胞[11]。然而，屬于細胞漿蛋白成分的細胞角蛋白標記物不能用于干細胞的分離和純化。

1.3 皮膚多能干細胞

Oshima等[12]曾通過LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊的隆突區(qū)置換成野生型毛囊，進行嵌合體移植實驗和組織學動態(tài)研究，結(jié)果證實隆突區(qū)域的細胞參與毛發(fā)、表皮和腺體結(jié)構(gòu)的形成。而且連環(huán)蛋白在隆突區(qū)域細胞選擇性形成表皮細胞或毛發(fā)過程中起重要作用[13]。Zuk等[14]研究證實，人體脂肪組織中存在能向軟骨細胞、骨細胞和肌細胞分化的干細胞。該細胞具有骨髓間充質(zhì)干細胞相似的性質(zhì)，可從脂肪組織中較容易地分離和培養(yǎng)擴增。Okochi等[15]先將小鼠皮膚剪碎，再用胰蛋白酶進行消化分離，懸浮培養(yǎng)1～2周后得到懸浮生長的細胞團。這些細胞在從懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)為貼壁培養(yǎng)時，會因為分化條件不同而相應地向βⅢ微管蛋白陽性的神經(jīng)細胞、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。同理，也能誘導產(chǎn)生α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性的平滑肌細胞和油紅（Oil red）陽性的脂肪細胞。由于缺乏可靠的標記物，因此尚未清楚皮膚組織中的這些多能干細胞存在的確切部位。與異體ES細胞和胚胎腦獲取的神經(jīng)細胞相比，自體皮膚誘生的神經(jīng)細胞不會引發(fā)排斥反應，具有更廣泛的臨床應用價值。此外，來自骨髓的成體干細胞在合適的體內(nèi)外環(huán)境中可分化為表皮細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等[16]。

2 干細胞在皮膚再生醫(yī)學中的應用

嚴重燒傷患者常應用同種異體皮膚移植，[17]然而，這種移植一般僅能起到暫時覆蓋創(chuàng)面的作用。近30年，許多患者得益于通過細胞培養(yǎng)而得到的細胞治療產(chǎn)品。通過自體表皮角質(zhì)細胞的培養(yǎng)，大量嚴重燒傷患者得到了有效治療[18-19]。

已有的研究證實，多能干細胞可分化為表皮細胞和真皮細胞[21]，多種組織工程皮膚產(chǎn)品已獲得美國FDA批準。

Green等[22-23]通過體外培養(yǎng)患者的角質(zhì)細胞，并將這些細胞產(chǎn)品應用于大面積燒傷患者，可以預防感染和脫水[24]。另外，利用同種異體細胞進行臨時表皮細胞替代的治療方法還可以運用于其他皮膚疾病的治療，特別是某些皮膚潰瘍性疾病和某些遺傳性皮膚病[25-27]。

傷口治愈可能并不需要移植組織的永久保存。事實上，無論是生物性的無細胞基層，或者甚至是包含有纖維、膠原蛋白和透明質(zhì)酸等生物性物質(zhì)的基層等，在對其進行自體移植的時候，都會和同種異體的角質(zhì)細胞移植時出現(xiàn)相同的情況，及逐漸排斥。除了對創(chuàng)面的臨時覆蓋作用，還可以刺激細胞的內(nèi)生性增殖和創(chuàng)面周圍正常組織中的干細胞向創(chuàng)面聚集[28]。

目前，皮膚再生醫(yī)學方面還包括基因治療相關(guān)內(nèi)容，如以Ⅶ型膠原基因轉(zhuǎn)染治療惡性營養(yǎng)障礙性表皮水皰癥等[29]。

創(chuàng)傷愈合過程中，生長因子調(diào)控著損傷后皮膚再生的全過程，包括細胞趨化、增殖、基質(zhì)合成與降解、炎癥反應等多個方面。因此，在以往的臨床實踐中，常采用堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）和角朊細胞生長因子（KGF）等促有絲分裂的生長因子，以加速創(chuàng)面愈合和改善創(chuàng)面修復。然而，上述生長因子的外用效果十分有限，可能與生長因子的半衰期短暫、活性作用和生物利用度較低或需要攜帶其他（蛋白）分子等因素有關(guān)?；蛑委煹膬?yōu)點是可以克服生長因子外用的種種不足，能夠通過局部活細胞主動和長期的表達來實現(xiàn)。目前，角朊細胞進行基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)較為成熟，但隨著角朊細胞的不斷分化，移植物在活體最終以“痂皮”的形式脫落。因此，除干細胞外，將基因?qū)肫渌审w細胞，尚無法取得良好的治療效果。

3 干細胞與人體組織及皮膚衰老的關(guān)系

人體組織衰老可以分為病理性及生理性，通過對Hutchinson-Gilford早老綜合癥（HGPS）的研究，人們試圖明白機制的區(qū)別；同時，探索對衰老過程的延緩，甚至逆轉(zhuǎn)[30]。

HGPS是人類一種少見并且致命的提前衰老的疾病[31-35]，表現(xiàn)為過早的動脈硬化和血管平滑肌細胞（SMCs）的退行性病變[36-38]。HGPS是由于核纖層蛋白的單個基因位點突變所引起的，而這個核纖層蛋白的基因位點的截短導致了家族中某代出現(xiàn)早老、早熟癥狀。各器官早老現(xiàn)象的積蓄導致了各種與衰老相關(guān)的核功能的障礙，包括核的裂解破碎以及異染色質(zhì)的缺乏[37-40]。Liu等[30]報道了從HGPS患者體能獲得的成纖維細胞所得到的iPSCs。HGPS-iPSCs表現(xiàn)出progerin（導致干細胞激變的某種蛋白）的缺乏，更重要的是，核被膜的缺失是伴隨著提早衰老的變化而逐漸形成的。再隨著HGPS-iPSCs的分化，progerin和與衰老相關(guān)的表型又重新出現(xiàn)。直接由HGPS-iPSCs分化至SMCs，導致早老的各種癥狀與血管老化密切相關(guān)。另外，該研究還鑒別出DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNAPKcs，也被認為是PRKDC）作為progerin的下游目標。細胞核缺少全酶DNAPK與早老及生理性衰老都相關(guān)。因為生理性衰老時，progerin也會聚集[36，40-41]。

生理性衰老的過程中或特殊疾病狀態(tài)下，存在基因改變的蓄積作用，但有望通過細胞重編程加以修復[31，39-40]。最近的研究認為，正常的老化過程和HGPS相關(guān)的血管硬化過程，具有相似之處[36，41]。事實上，在生理性衰老的過程中，progerin的水平逐漸增高。在相關(guān)報道中可以看出，用progerin依賴的方法，SMCs分化出的HGPS-iPSC比對照組的正常老化過程的表型更早出現(xiàn)[31]。

4 展望

現(xiàn)在的研究認為，皮膚干細胞是皮膚再生的主要資源，皮膚是基因治療的最適場所，可將皮膚干細胞作為基因治療的靶細胞。但是，基因治療還存在安全性和控制表達量等問題[44]。

目前，干細胞的臨床應用存在安全隱患。使用動物血清培養(yǎng)干細胞，可能導致動物性病原微生物和病毒感染；異體的干細胞移植可能存在的疾病傳染的風險；基因轉(zhuǎn)染的干細胞存在惡性變的可能，尤其是采用病毒載體進行轉(zhuǎn)染時[45]。

因此，在皮膚損傷的修復以及皮膚年輕化中應用細胞治療，尚屬于實驗探索階段，還無法規(guī)范化及規(guī)?；貞糜谂R床。但是，現(xiàn)有的研究結(jié)果揭示了細胞治療（尤其是干細胞）在這方面所蘊含的廣闊前景，今后必將在皮膚損傷修復和年輕化治療方面發(fā)揮積極的作用，并有可能從根本上改變現(xiàn)有的治療模式。

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Research Progress of Apply Stem Cell for Skin Tissue Regeneration and Rejuvenation

CHANG Yi,YANG Songlin.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicina,Shanghai 200233,China.

YANG Songlin(E-mail:alcee@126.com).

Stem cell;Rejuvenation;Skin;Cell Reprogramming

Q813.5

B

1673－0364（2012）05－0298－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.015

200233 上海市 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

楊松林（E-mail：alcee@126.com）。

【Summary】Stem cells have ability of self-renewal and self-replicate.It is widely used in various medical fields,including the regeneration of skin damage.As a special form of tissue regeneration,the rejuvenation is also inseparable from stem cells.In this article,research progress on stem cells for skin tissue regeneration and rejuvenation has been reviewed.

2012年7月14日；

2012年9月25日）