體內(nèi)組織工程構(gòu)建小口徑人工血管的研究進(jìn)展

王淑芳，鄭文婷，孔德領(lǐng)

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071)

體內(nèi)組織工程構(gòu)建小口徑人工血管的研究進(jìn)展

王淑芳，鄭文婷，孔德領(lǐng)

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071)

小口徑血管在臨床上有很大需求，但小口徑血管再狹窄率很高。體內(nèi)組織工程是改善小口徑血管功能、實(shí)現(xiàn)血管再生的有效手段。介紹了小口徑人工血管的國內(nèi)外研究發(fā)展動(dòng)態(tài)，詳述了作者實(shí)驗(yàn)室在構(gòu)建小口徑人工血管方面的設(shè)計(jì)思路和研究所取得的主要進(jìn)展。研究包括支架材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備技術(shù)，支架材料表面功能化修飾，內(nèi)皮祖細(xì)胞捕捉，血管平滑肌再生，抗凝血和促內(nèi)皮細(xì)胞黏附，血管再生微環(huán)境的構(gòu)建等。最后對(duì)小口徑人工血管研究尚需解決的科學(xué)問題和研究方向進(jìn)行了討論。

人工血管;組織工程;支架制備;干細(xì)胞捕捉;內(nèi)皮化;平滑肌再生;細(xì)胞外微環(huán)境

1 前言

小口徑血管在臨床上有很大需求，美國心臟協(xié)會(huì)2010年報(bào)道，每年大約有500 000冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)［1］，另外超過100萬的患者因嚴(yán)重的下肢缺血需要血管移植［2］。在我國每年也有大量需求。但如今在臨床上常用的大口徑血管材料(ID＞6 mm)ePTFE和Daron，如果作為小口徑血管材料，再狹窄率很高。在過去的20～30年間，小口徑人工血管的研究手段主要是組織工程。對(duì)材料表面進(jìn)行抗凝血修飾，在植入體內(nèi)之前，在材料表面種植內(nèi)皮細(xì)胞，并借助生物反應(yīng)器進(jìn)行組織培養(yǎng)［3］。

然而，組織工程研究方法存在許多局限。在體外構(gòu)建的小口徑血管在植入體內(nèi)后常常出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞層脫落、內(nèi)皮細(xì)胞在短期內(nèi)被取代、內(nèi)皮細(xì)胞功能不全、血管再狹窄率高等問題。組織工程構(gòu)建過程需要病人自體細(xì)胞的分離、體外擴(kuò)增、與支架材料一起通過生物反應(yīng)器長時(shí)間培養(yǎng)，發(fā)生細(xì)菌感染的幾率高，構(gòu)建的組織工程血管不宜儲(chǔ)存和運(yùn)輸、成本很高等，臨床應(yīng)用的可操作性較差［4］。血管組織工程的研究開展這么多年來，還沒有小口徑血管材料的臨床實(shí)驗(yàn)。因此，需要突破傳統(tǒng)的研究思路，尋求一種生產(chǎn)更為簡單、臨床應(yīng)用的操作性更強(qiáng)的小口徑人工血管的研究方法。

近年來，在組織工程與組織再生領(lǐng)域，越來越多的學(xué)者提出“體內(nèi)組織工程”的思路［5－6］。具體來說，就是強(qiáng)調(diào)對(duì)支架材料進(jìn)行活性和功能修飾，使植入的支架材料在體內(nèi)募集捕捉干細(xì)胞，誘導(dǎo)血管新生和干細(xì)胞分化與增殖，促進(jìn)組織的迅速修復(fù)和再生，使組織構(gòu)建在體內(nèi)完成。與傳統(tǒng)組織工程研究手段不同之處，在于沒有細(xì)胞接種和體外培養(yǎng)，依靠材料調(diào)動(dòng)人體自我康復(fù)能力，引導(dǎo)或誘導(dǎo)受損組織/器官再生。因此，體內(nèi)組織工程材料的主要研究內(nèi)容，是支架材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與加工、材料的活性修飾與組織再生微環(huán)境構(gòu)建。對(duì)于小口徑人工血管來說，支架材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)主要考慮材料的力學(xué)強(qiáng)度、順應(yīng)性、孔結(jié)構(gòu)和生物降解性，對(duì)支架材料的活性修飾，除了組織再生微環(huán)境修飾，更重要的是表面抗凝血修飾和促內(nèi)皮細(xì)胞黏附的特異性修飾。

2 支架材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)加工及其對(duì)血管形成過程的影響

高分子材料的來源、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)血管支架材料至關(guān)重要。血管的細(xì)胞外基質(zhì)主要是膠原納米纖維，因此，采用靜電紡絲方法制備血管支架材料能夠模擬血管細(xì)胞外基質(zhì);采用合適的高分子材料和材料復(fù)合與加工技術(shù)，可以獲得力學(xué)性能與天然血管相似的血管支架。

2.1 材料的選擇與制備

在制備人工血管時(shí)選擇高分子材料主要考慮材料的力學(xué)性質(zhì)、生物相容性和可降解性。膠原、殼聚糖、纖維素、明膠、透明質(zhì)酸等天然高分子生物相容性好，但是力學(xué)強(qiáng)度較差。聚已內(nèi)酯(PCL)，聚乳酸(PLA或PLLA)，聚羥基乙酸(PGA)等合成高分子及其共聚物PLGA，PLCL等，力學(xué)性質(zhì)和降解性可以控制，但是普遍缺少生物活性，需要進(jìn)行生物功能化修飾。多年來PCL在人工血管及其它支架材料中應(yīng)用普遍，它具有良好的生物相容性和力學(xué)性能。作為血管材料它的不足之處是降解太慢，對(duì)血管再生構(gòu)成障礙。需要選擇更合適的高分子材料，或者采取不同高分子材料的復(fù)合，解決支架材料的力學(xué)強(qiáng)度、降解速率與組織再生進(jìn)程的平衡關(guān)系。

還有一類可降解高分子材料，近年來特別受關(guān)注，它們是通過生物途徑合成的聚合物，其中，最具代表性的是聚羥基脂肪酸酯PHA類材料。其中一個(gè)成功的例子是PLA/PHBHHx復(fù)合體系。PLA具有較高的力學(xué)強(qiáng)度、良好的降解性和加工性。但最大的缺點(diǎn)是脆性較高;而聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸(PHBHHx)是PHA系列聚合物的一個(gè)新品種，由于具有較長的側(cè)鏈，其結(jié)晶度較低，是一種“軟而韌”的聚合物，而且，PHBHHx體外降解速率較慢。研究表明，這兩種聚合物在力學(xué)性能和生物降解性等方面具有很大的互補(bǔ)性，在某些比例條件(如80/20或20/80)下形成微相分離結(jié)構(gòu)(如圖1)，材料綜合性能良好［7］。利用該材料構(gòu)建人工血管的研究正在進(jìn)行中。

近年來，一些研究組潛心研究新型抗凝血組織工程材料。袁直等將乳酸與蘋果酸共聚形成PLMA，再用多肽GRGDS修飾，形成含RGD多肽的高分子PGS5，研究了其抗凝血性，結(jié)果顯示PGS5抗凝血性良好(如圖2)，有潛力用于血管組織工程［8］。

2.2 靜電紡絲制備超細(xì)纖維多孔支架材料

人工血管要滿足一定的抗張強(qiáng)度，最重要的是需要具備連通性的孔結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞遷移和各種生物活性分子的傳遞。常用的制備方法有鹽析、氣體發(fā)泡和相分離等。但是，靜電紡絲技術(shù)更適合人工血管的制備。這是因?yàn)殡娂徑z技術(shù)制備的三維纖維結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)很相似。纖維直徑可以從幾十納米到幾微米，同時(shí)具有孔隙率高、比表面積大、孔徑分布較寬的特點(diǎn)。電紡絲制得的無紡布，是由不同取向的纖維堆積而成，纖維之間是疏松的。當(dāng)細(xì)胞黏附到纖維表面時(shí)，可以推動(dòng)周圍的纖維以擴(kuò)展空間，從而提高材料的細(xì)胞滲透性，有利于細(xì)胞的侵入生長。

靜電紡絲，簡稱電紡，是用高壓電源將一種極性的電荷引入聚合物溶液或熔體中，然后，聚合物溶液或熔體向帶有異性電荷的收集器加速。隨著溶液(或熔體)與收集器所帶的異性電荷之間的靜電引力以及溶液內(nèi)部同種電荷之間的靜電排斥作用的增強(qiáng)，溶液最前端的液面將由圓形新月面變成圓錐(稱為Taylor錐)。當(dāng)電場強(qiáng)度超過液體表面張力時(shí)，會(huì)從Taylor錐噴射出纖維。纖維穿過周圍環(huán)境，溶劑蒸發(fā)，然后固體聚合物纖維在收集器上沉積，形成無紡纖維氈結(jié)構(gòu)。利用這種方法制成的纖維其直徑一般在幾微米到幾十納米之間(如圖3)［9］。

在制備人工血管時(shí)，往往需要對(duì)兩種高分子材料進(jìn)行復(fù)合。從同一方向電紡的兩種高分子纖維由于同種電荷排斥作用，在接收器上不能均勻混合。采用圖4a的轉(zhuǎn)動(dòng)盤作為接收器，可以得到兩種高分子纖維均勻混合的靜電紡絲膜。采用圖4b接收裝置，可以加工靜電紡絲人工血管(圖4c)。圖4b的每根水平接收桿是轉(zhuǎn)動(dòng)的，接收桿直徑可以根據(jù)血管的內(nèi)徑需要進(jìn)行調(diào)換。當(dāng)使用兩種高分子加工血管時(shí)，高分子溶液從接收器兩側(cè)電紡，可實(shí)現(xiàn)兩種高分子纖維的均勻混合［10－11］。

2.3 通過加工工藝設(shè)計(jì)，制備有利于細(xì)胞向內(nèi)遷移的大孔支架材料

作者實(shí)驗(yàn)室一直以來，采用靜電紡絲PCL支架作為小口徑人工血管，但是，PCL纖維直徑小，纖維之間孔徑往往小于10 μm，在體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞很難遷移到支架內(nèi)部，在血管移植實(shí)驗(yàn)中，血管平滑肌再生困難，形成的平滑肌組織層位于支架表面上方，不在支架內(nèi)部［12］。近來開始嘗試通過水溶性高分子PEO進(jìn)行致孔，制備結(jié)構(gòu)疏松的PCL靜電紡絲血管。PEO致孔顯著改善了PCL靜電紡絲膜材料的孔徑和疏松程度，改善了細(xì)胞向支架材料內(nèi)部的遷移。

圖1 不同比例的PLA/PHBHHx的顯微紅外照片及相應(yīng)的譜圖Fig.1 FTIR-microscopic images for PLA/PHBHHx blends with various ratio and corresponding to spectra for labeled dots:(a1～a3)PLA/PHBHHx(40/60)，(b1～b3)PLA/PHBHHx(50/50)，(c1～c3)PLA/PHBHHx(60/40)，(d1～d3)PLA/PHBHHx(80/20)，and(e1～e3)PLA/PHBHHx(20/80))

圖2 高分子上黏附血小板的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of adherent platelets on bare polymers:(a)PDLLA，(b)PLMA，(c)P-GS5，and(a’～c’)magnified images of(a～c)

在靜電紡絲的同時(shí)，向纖維內(nèi)部噴入水溶性PEO微球，最后將微球溶解掉，產(chǎn)生需要的孔結(jié)構(gòu)。圖5顯示的是采用PEO致孔的PCL靜電紡絲膜。PEO溶液在電噴條件下形成直徑可調(diào)的微球，均勻混合在PCL纖維中間。將PEO微球洗掉以后，形成結(jié)構(gòu)更加疏松的支架材料。

靜電紡絲支架的不足之處是孔徑偏小，不利于細(xì)胞的遷移和向內(nèi)生長。研究人員嘗試各種靜電紡絲技術(shù)。如混合電紡，將兩種材料的纖維均勻地混合在一起，兩種高分子具有不同的降解速率，隨著其中一種纖維的快速降解，可以提供更多的細(xì)胞生長空間。如PCL和明膠復(fù)合材料，通過控制兩種高分子溶液的濃度、流速和接觸距離，來控制兩種纖維的直徑和含量比例。對(duì)紡絲膜進(jìn)行后交聯(lián)，可調(diào)節(jié)明膠的溶解和降解速率。靜電紡絲前將明膠和PCL分別用FITC和羅丹明B染色，用共聚焦顯微鏡觀察兩種顏色纖維的直徑、分布和混合程度。如圖6所示，兩種纖維能夠均勻混合形成組成均勻的材料。

最近有文獻(xiàn)報(bào)道疏松靜電紡絲支架的制備技術(shù)。作者在管狀接收器上鉆孔，將接收管與高壓氣體鋼瓶連接(如圖7)，在靜電紡絲過程中調(diào)節(jié)氣流壓力，可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)疏松的既有足夠力學(xué)性質(zhì)，又有良好細(xì)胞穿透效果的支架材料［13］。

以往的大量研究表明，血管移植后內(nèi)皮形成在幾周內(nèi)完成，但是，平滑肌再生卻困難得多。如果植入的人工血管不能形成有功能的平滑肌，血管缺乏收縮和舒張功能，勢必影響血管內(nèi)皮的功能。血管內(nèi)皮會(huì)發(fā)生老化，血管壁發(fā)生鈣化，血管變硬、變脆，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、新內(nèi)膜增生、血栓形成等。

圖5 靜電紡絲支架材料表面的SEM像:(a)傳統(tǒng)靜電紡絲制備的PCL膜材料，SEM顯示其纖維結(jié)構(gòu)致密，孔徑較小，(b)靜電紡絲PCL的同時(shí)，電噴PEO微米球所得到的復(fù)合支架材料，纖維與球的結(jié)合良好，且球的分布均勻，(c)通過梯度酒精脫水，將(b)中的PEO微米球洗去，進(jìn)行冷凍干燥得到只含有PCL纖維的3D膜材料，與(a)相比其纖維結(jié)構(gòu)疏松，孔徑增大Fig.5 SEM images of surface of scaffolds:(a)PCL membrane produced by traditional electrospinning，SEM showing fibers compact structure and small pore，(b)PCL-PEO composite scaffolds produced by electrospinning PCL and electrospraying PEO microparticles at the same time，SEM images showed uniform distribution of PEO microparticles，PCL fibers excessively combined with PEO microparticles，(c)3D PCL of PEO microparticle removed by gradient alcohol to water and then dehydrated with －20℃ and frozen dryly，SEM images showed scaffolds of loose structure compared with TS PCL scaffolds and pore diameter in 3D PCL scaffolds more bigger than TS PCL scaffolds(a)

圖6 明膠與PCL共紡纖維的共聚焦像:明膠纖維和PCL纖維Fig.6 Confocal images of fluorescence stained fibers blend:gelatin fiber and PCL fiber

圖7 實(shí)驗(yàn)所用的穿孔模芯:(a)標(biāo)注尺寸的模芯，(b)連接有空氣流的模芯裝置，上方箭頭所指處為氣流進(jìn)口壓力，下方箭頭所示方向?yàn)闅饬鞣较騀ig.7 Images depicting perforated mandrel used in our experiment:(a)mandrel labeled with dimensions，(b)mandrel device connected with air line，above arrow showing location of inlet pressure，and down arrow showing direction of air-flow

瑞士Walpoth實(shí)驗(yàn)室對(duì)靜電紡絲技術(shù)制備的聚已內(nèi)酯(PCL)小口徑血管，進(jìn)行了大鼠腹主動(dòng)脈長期移植研究［14］。他們發(fā)現(xiàn) PCL具有很好的生物相容性和組織順應(yīng)性，即使不做任何修飾，PCL血管的內(nèi)皮形成在2～4周內(nèi)完成，18個(gè)月以后新內(nèi)膜增生輕微，血管管腔幾乎沒有狹窄。然而，他們發(fā)現(xiàn)在血管植入大鼠體內(nèi)1.5個(gè)月后出現(xiàn)一些軟骨樣細(xì)胞。12個(gè)月后，軟骨樣細(xì)胞繼續(xù)增多，在18個(gè)月時(shí)大部分支架呈現(xiàn)鈣化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，遷移進(jìn)入血管支架內(nèi)的細(xì)胞密度和微小血管密度在6個(gè)月時(shí)達(dá)到最大，在后期細(xì)胞和微血管密度反而下降(如圖8［14］)。這些現(xiàn)象表明，平滑肌再生不完善，血管壁內(nèi)部沒有實(shí)現(xiàn)很好的細(xì)胞化，支架孔徑小，纖維降解慢，小血管密度低，血管壁細(xì)胞缺乏足夠的營養(yǎng)，是導(dǎo)致后期血管鈣化的主要原因。

人工小口徑血管移植后，血管的再生過程涉及到細(xì)胞重塑，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，也稱為表型轉(zhuǎn)化。在正常狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞主要表現(xiàn)為收縮型，位于血管壁中層，通過細(xì)胞收縮使血管壁維持一定張力。但在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病出現(xiàn)時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞便會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，以增殖型為主，在各種刺激因素和生長因子作用下，由中層遷入內(nèi)膜并大量增殖，導(dǎo)致血管壁增厚。在人工血管移植治療中，平滑肌細(xì)胞將首先表現(xiàn)為增殖型，然后轉(zhuǎn)化為收縮型。

圖8 血管壁隨時(shí)間的生物學(xué)響應(yīng)示意圖Fig.8 Schematic representation of biological response in vascular graft wall over time

血管平滑肌再生，可以從人工血管結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和活性修飾方面去解決。Guobao Weii等［15］已經(jīng)將生長因子控釋技術(shù)與三維靜電紡絲支架結(jié)合起來，制備出能夠穩(wěn)定控釋血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的支架。在下一步實(shí)驗(yàn)中，他們準(zhǔn)備將二者結(jié)合起來，進(jìn)一步研究體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，形成人工血管的技術(shù)手段。Jiang Hu［16］等采用復(fù)合相分離與電紡技術(shù)構(gòu)建了含大孔的高孔隙率、3D貫通孔結(jié)構(gòu) PLLA支架(如圖9［16］)，并用于人平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行表型轉(zhuǎn)變，起到了良好效果(如圖10［16］)。他們將人大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)種植于該管狀支架(內(nèi)徑3 mm，外徑5 mm，長4 mm)上，體外培養(yǎng)24 h，然后，將其或空白支架(未種植細(xì)胞)分別植入裸鼠皮下，2周后取材，進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)檢測。H＆E染色結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組都有組織的形成，這是由于PLLA血管支架的3D多孔結(jié)構(gòu)為組織的形成提供了可能性(圖10 a)。馬氏染色證實(shí)材料周圍及其內(nèi)部分布大量膠原蛋白(圖10 c)，為形成細(xì)胞外基質(zhì)，加速平滑肌細(xì)胞的快速增殖創(chuàng)造了條件。IgG對(duì)照的免疫組化染色說明了材料中未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)(圖10 d)，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組結(jié)果的真實(shí)性。利用平滑肌細(xì)胞-α-肌動(dòng)蛋白抗體(SM-α-actin)對(duì)鼠源的平滑肌細(xì)胞著色，發(fā)現(xiàn)在材料中有一些平滑肌肌動(dòng)蛋白的分布(圖10 e)。人線粒體抗體對(duì)皮下埋植后的材料染色，看到材料內(nèi)部有線粒體的存在(圖10 f)，說明平滑肌細(xì)胞分化作用的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了PLLA血管支架特有的3D多孔結(jié)構(gòu)，可以允許體外種植的HASMCs遷移到支架內(nèi)部，而且有分化作用的發(fā)生，同時(shí)也有宿主自身細(xì)胞的遷移。該研究顯示，這種含大孔的高孔隙率、3D貫通孔結(jié)構(gòu)的支架材料，對(duì)于細(xì)胞向內(nèi)生長和構(gòu)建組織工程血管都極為重要。

圖9 含大孔的管狀納米纖維多孔支架:(a)管狀支架全貌，(b)支架橫截面，(c)大孔和貫通孔結(jié)構(gòu)及(d)納米纖維結(jié)構(gòu)的SEM照片F(xiàn)ig.9 Photographs of tubular nano-fibers scaffolds:gross view of tubular scaffold(a)，SEM micrographs of scaffold cross-section(b)，macropores and pore interconnections structure(c)，and nano-fibers structure(d)

圖10 HASMCs細(xì)胞在支架上種植培養(yǎng)24 h后體內(nèi)移植情況:(a)H-E染色，(b)空白支架，(c)移植2周后Masson染色，(d)移植2周之后IgG免疫組化染色(膠原ECM染藍(lán)色)，(e)用SMA-actin抗體染色植入宿主SMCs，(f)用人線粒體抗體染色的植入HASMCsFig.10 In vivo implantation of HASMCs-scaffold constructs after 24 h of cell seeding and culture:H-E staining of sections of construction(a)，blank scaffolds(b)，masson's trichrome after 2 weeks of implantation(c)，staining of 2 weeks implants of construction(collagenous ECM stained blue)，immunohistochemical staining of IgG control 2 weeks after implantation(d)，implanted host SMCs stained with SMA-actin antibody(e)，and implanted HASMCs stained with human mitochondria antibody(f)

3 支架材料表面功能化修飾

人工血管表面修飾，主要是抗凝血修飾和促內(nèi)皮細(xì)胞黏附修飾?？鼓揎棧饕潜砻娓嗡鼗?7－18］和接枝兩性離子如磷酰膽堿(MPC)［19－21］等。這類研究開展得很多，方法比較成熟，這里不再重點(diǎn)介紹。

3.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)捕捉

近年來人工血管表面修飾，主要是針對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的特異修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)外周血EPC的捕捉，使血管材料植入體內(nèi)后在原位實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化［22］。這種手段可以避免組織工程方法中的種子細(xì)胞來源、體外培養(yǎng)、內(nèi)皮層脫落、產(chǎn)品儲(chǔ)存等問題?？捎糜诓蹲紼PC并促進(jìn)干細(xì)胞分化的生物分子包括:血管內(nèi)皮生長因子VEGF，神經(jīng)生長因子NGF等;內(nèi)皮干細(xì)胞特異抗體CD34［5］，KDR，CD133等;其它細(xì)胞粘附分子 RGD和DNA適配體［5］等。圖11是EPCs在涂覆了EPC特異捕獲分子的人工血管支架的捕獲情況示意圖［22］。圖中表示多肽、蛋白、抗體、磁性分子、適配體都可作為EPCs的捕獲分子，這些分子與EPCs上的靶點(diǎn)鍵合，將內(nèi)皮祖細(xì)胞固定在移植物表面，然后，捕獲的EPCs能夠分化成內(nèi)皮細(xì)胞，并在人工血管上形成內(nèi)皮層。高分子支架表面具有血液相容性和抗凝血性的涂層，可以阻止其它血細(xì)胞或絲素蛋白黏附于表面。

圖11 EPCs在涂覆了EPC特異捕捉分子的人工血管支架上的捕獲情況示意圖Fig.11 Immobilisation of EPCs on artificial vascular grafts coated with EPC-specific capture molecules

Orbus Neich公司將CD34抗體固定到冠狀動(dòng)脈支架表面，生產(chǎn)出可捕獲內(nèi)皮干細(xì)胞、快速實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化的支架 Genous(TM)Bio-engineered R Stent(TM)［23］，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。Genous血管支架表面固定CD34抗體，在植入體內(nèi)1 h后，可觀察到大量的細(xì)胞粘附，48 h后，可形成幾乎完整的類似血管內(nèi)皮的單層。表明CD34表面捕捉細(xì)胞的效率很高，這些被捕捉的細(xì)胞，加速了血管內(nèi)皮的進(jìn)程。臨床研究表明，該支架可募集血液循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞到支架表面，加速血管損傷部位的內(nèi)皮自然修復(fù)，促使支架更好地與周圍血管組織相容，減少血栓形成的機(jī)率，降低再狹窄的發(fā)生。在植入26 d后可形成完全正常的血管內(nèi)皮。

Rotmans實(shí)驗(yàn)室［24］將CD34抗體固定到以ePTFE為材料的人工血管上，植入豬體內(nèi)后，3 d可以實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化。但是，該研究發(fā)現(xiàn)CD34抗體修飾的血管材料，同樣會(huì)發(fā)生內(nèi)膜增生。

國內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室在近幾年也開始了類似的研究，如黃楠實(shí)驗(yàn)室開展了用于改善心血管植入金屬支架的研究。他們利用層層自組裝技術(shù)，在Ti表面涂布了多層的CD34抗體。這種方法是先在NaOH處理的Ti基質(zhì)表面沉積一層抗生物素蛋白，再沉積一層生物素化的蛋白A與之前一層相結(jié)合，最后，CD34抗體通過其Fc片段與蛋白A結(jié)合，露出與抗原結(jié)合的Fab段。在這種修飾了的Ti表面培養(yǎng)EPC，并將其植入狗的腹主動(dòng)脈，結(jié)果表明，CD34抗體修飾的表面，能夠增強(qiáng)EPC的粘附和捕捉，在體內(nèi)能誘導(dǎo)內(nèi)腔表面的快速內(nèi)皮化［25］。除此之外，他們還利用一種結(jié)合了靜電作用和共價(jià)修飾的方法，在氨基硅烷化的Ti表面，形成肝素和纖連蛋白涂層。首先將兩種生物活性分子混合通過靜電作用來形成超分子復(fù)合體，之后用基于硅烷的方法，將復(fù)合物共價(jià)連接在Ti表面。初步的工作結(jié)果表明，肝素和纖連蛋白的RGD多肽位點(diǎn)都是有功能的。這種修飾后的材料，具有良好的血液相容性。而且相對(duì)于Ti材料，修飾后促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的粘附增殖等［26］。

3.2 抗菌和抗凝血修飾

計(jì)劍實(shí)驗(yàn)室在2003年通過靜電自組裝(ESA)的方法成功地在不銹鋼支架表面加入了PEI和肝素，通過接觸角和電化學(xué)阻抗分光學(xué)的方法證明了21 d后在Tris-HCl緩沖液中這種涂層仍然是穩(wěn)定的，而通過血小板粘附和靜態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明，這種帶有PEI/肝素涂層的不銹鋼支架，具有一定抑制血小板粘附、延長凝血時(shí)間的作用［27］。該實(shí)驗(yàn)室在2005年通過層層自組裝的方法構(gòu)建了一種能夠抗粘附和抗菌的材料。他們利用殼聚糖抗菌和肝素抗粘附的性質(zhì)在氨化的PET表面層層自組裝殼聚糖和肝素。大腸桿菌的粘附實(shí)驗(yàn)，說明了在PET表面粘附的大腸桿菌大大高于自組裝后的材料，而且粘附的細(xì)菌數(shù)量會(huì)隨著組裝后pH的降低而減少，表明多層的殼聚糖/肝素能夠有效殺死細(xì)菌。這種簡單而有效的方法為抗粘附和抗菌的表面修飾提供了選擇［28］。

3.3 材料表面修飾方法

材料表面的修飾方法有多種，包括共價(jià)鍵形式的基團(tuán)修飾和化學(xué)接枝，包括分子之間的生物結(jié)合，如抗原與抗體、生物素與結(jié)合素、蛋白與蛋白等之間的親和作用，還包括非共價(jià)鍵形式的吸附、涂層和自組裝?；瘜W(xué)修飾往往是對(duì)材料表面進(jìn)行改性，如改變電荷性質(zhì)，由電正性表面轉(zhuǎn)變?yōu)殡娯?fù)性表面，或者由疏水表面變?yōu)橛H水表面。在生物材料研究中，往往需要對(duì)材料進(jìn)行活性修飾，即向材料內(nèi)部或表面引入活性分子，如生長因子、酶或DNA。如果采取化學(xué)接枝方法，會(huì)導(dǎo)致這些活性分子的失活，而物理吸附方式達(dá)不到對(duì)活性分子的穩(wěn)定固定。

張旻等采用一種具有兩親性的蛋白HFBI在PCL靜電紡絲支架表面自組裝，將PCL表面的疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，提高了支架的細(xì)胞相容性和血液相容性。同時(shí)通過蛋白－蛋白之間的相互作用，將CD31抗體吸附固定在HFBI自組裝涂層的PCL支架表面，提高了支架材料表面對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力(見圖12［29］)。由于HFBI可以結(jié)合多種蛋白，這是一個(gè)通用性方法，可以用于對(duì)其它蛋白分子的固定。這種固定方法是分子之間的相互作用，是生物結(jié)合，非化學(xué)鍵固定。既具有足夠的穩(wěn)定性，又能很好地保持固定分子的生物活性。

圖12 HFBI固定CD31抗體捕捉內(nèi)皮細(xì)胞Fig.12 Immobilization of anti-CD31 antibody on surface of electrospun PCL scaffolds through HFBI and subsequently specific capture of endothelial cells

對(duì)人工血管進(jìn)行表面功能化修飾時(shí)，往往需要固定 多種生物分子，包括肝素、抗體、多肽或生長因子。作者實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了一種基于環(huán)糊精－金剛烷之間主客體相互作用的表面修飾方法［30］。首先向材料表面固定環(huán)糊精分子，根據(jù)需要控制環(huán)糊精在材料表面的接枝密度。同時(shí)，對(duì)客體分子進(jìn)行金剛烷修飾。然后，通過金剛烷與環(huán)糊精分子之間的主客體組裝，實(shí)現(xiàn)活性分子在材料表面的固定。環(huán)糊精與金剛烷之間的結(jié)合不僅特異性強(qiáng)，而且結(jié)合牢固。這種修飾方法的優(yōu)點(diǎn)是:①等量反應(yīng)，由于主客體識(shí)別專一性強(qiáng)，材料表面的環(huán)糊精分子數(shù)目決定活性分子的固定量。該方法具有“模塊化”的特點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用選擇不同類型的生物活性分子進(jìn)行修飾，獲得所需的表面性質(zhì)。②組成比例可控，有些情況下需要多種活性分子共同修飾，如支架材料表面需要肝素、抗體、生長因子等。由于活性分子的固定只取決于環(huán)糊精和金剛烷之間的分子識(shí)別，與活性分子的性質(zhì)無關(guān)，因此，可以根據(jù)需要確定兩種或多種活性分子的投料比，即可以準(zhǔn)確控制其在材料表面的相對(duì)比例，這是其它方法，如共價(jià)鍵結(jié)合或物理吸附所不能實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)驗(yàn)方法如圖13所示。在實(shí)驗(yàn)中選用了纖維素基支架材料，首先將環(huán)糊精分子共價(jià)偶聯(lián)到纖維素纖維表面。同時(shí)合成了分子鏈兩端帶有金剛烷基團(tuán)的聚己內(nèi)酯(PCL)客體分子。最后，通過環(huán)糊精與金剛烷之間的主－客體相互作用將PCL分子鏈固定在纖維表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)纖維的表面修飾［30］。

圖13 采用主客體自組裝方法的支架材料表面修飾示意圖Fig.13 Synthesis pathway for cellulose-CD and PCL-AD and the conceptual illustration surface modification for self-assembly process of cellulose-CD with guest polymer PCL-AD

孔德領(lǐng)實(shí)驗(yàn)室合成了一種帶有RGD肽的可自組裝成膠的小分子Nap-FFGRGD。該分子在一定條件下可形成水凝膠，可以在PCL靜電紡絲支架表面自組裝涂層，將PCL纖維表面改性，提高親水性，抑制血小板黏附，并改善細(xì)胞的黏附與伸展［31］。接下來，該實(shí)驗(yàn)室利用Nap-FFGRGD涂層修飾的小口徑人工血管開展了兔子頸動(dòng)脈移植研究。在體外實(shí)驗(yàn)中，修飾材料顯著提高了捕捉內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血小板粘附與聚集的能力。通過AV-shunt模型檢測修飾后PCL支架(PCL-RGD)的血液相容性。對(duì)體外循環(huán)2 h后的血管支架進(jìn)行SEM分析，觀察到PCL支架內(nèi)表面粘附有大量血小板，而PCL-RGD支架表面基本上沒有血小板粘附。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，植入3 d后，通過SEM觀察材料內(nèi)表面，在PCL支架上有大量的血小板、紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及纖維蛋白構(gòu)成的血栓基質(zhì)沉積，但是修飾后的材料內(nèi)表面是光滑的，基本沒有血小板粘附，證明了其很好的血液相容性。植入4周后(n=5)，利用數(shù)字減影血管造影(DSA)測定PCL-RGD支架全部通暢，而PCL由于血栓的形成，支架通暢率只有60%。取材后用SEM觀察支架材料內(nèi)表面，發(fā)現(xiàn)在PCL支架粘附有一些血栓基質(zhì)，而在PCL-RGD支架是沒有的，說明該修飾改善了材料的血液相容性(如圖14)。此外，通過HE染色可以看到在PCL-RGD支架上細(xì)胞浸潤顯著增加，而且細(xì)胞分布更加均勻;通過CD31免疫熒光染色，PCL-RGD支架的內(nèi)皮化進(jìn)程大約是PCL支架的3倍;通過α-SMA染色觀察平滑肌再生發(fā)現(xiàn)，4周時(shí)支架內(nèi)表面在內(nèi)皮層下均不同程度的長有平滑肌細(xì)胞層，PCL-RGD的平滑肌細(xì)胞平均覆蓋面積有65%，比其在PCL支架上高出23%。說明了RGD的修飾促進(jìn)了細(xì)胞在PCL材料內(nèi)部的遷移，加速了血管支架的內(nèi)皮化和平滑肌進(jìn)程(如圖15［12］)。

圖14 AV-shunt檢測修飾后PCL支架(a)和PCL-RGD支架(b)的血液相容性的SEM照片及血管支架植入兔頸動(dòng)脈3 d后PCL支架(c)和PCL-RGD(d)支架內(nèi)表面，血管支架植入4周后的PCL支架(e)和PCL-RGD(f)支架內(nèi)表面的SEM照片F(xiàn)ig.14 SEM images showing platelet adhesion on the grafts after exposed to blood for 2 h in AV-shunt experiment:(a)PCL grafts and(b)PCL-RGD grafts.The adhesion of platelets and mononuclear cells in PCL and PCL-RGD grafts for 3 d after implantation:(c)PCL and(d)PCL-RGD respectively.SEM images for luminal surface of explanted grafts at 4 weeks after implantation:(e)PCL grafts and(f)PCL-RGD grafts

圖15 通過CD31免疫熒光染色觀察內(nèi)皮化情況。4周取材后的內(nèi)皮化比率是通過縱切計(jì)算的。＊＊P＜0.01.PCL組(n=3)，PCL-RGD組(n=5)Fig.15 Endothelium characterization by immunofluorescence staining using CD31 antibody.The ratio of endothelialization at 2 and 4 weeks after implantation was calculated based on the staining of longitudinal sections.＊＊P ＜0.01.PCL group(n=3);PCLRGD group(n=5)

4 血管再生微環(huán)境的構(gòu)建

支架材料的組織再生微環(huán)境非常重要。向支架材料中復(fù)合各種細(xì)胞外基質(zhì)，以及與血管再生相關(guān)的各種生長因子，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的遷移、黏附、增殖以及分化，為人工血管植入后內(nèi)皮形成和平滑肌再生提供適宜的微環(huán)境［16－17］。

4.1 生長因子復(fù)合于支架材料

杜鳳儀等制備了殼聚糖/聚己內(nèi)酯(CS/PCL)質(zhì)量梯度靜電紡絲支架，并負(fù)載肝素和VEGF，仿生構(gòu)建血管壁微環(huán)境［32］。該支架材料抗凝血性增強(qiáng)，能穩(wěn)定持續(xù)釋放VEGF，促進(jìn)快速誘導(dǎo)內(nèi)皮化。通過兩種高分子纖維的梯度分布控制，實(shí)現(xiàn)肝素與VEGF在血管壁內(nèi)層高密度固定，達(dá)到抗凝血和誘導(dǎo)內(nèi)皮化形成的作用，同時(shí)減弱肝素和VEGF對(duì)血管壁內(nèi)部平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。該研究為小口徑血管組織再生微環(huán)境的構(gòu)建提出了新思路。

圖16是血管組織工程支架梯度電紡與均勻電紡的示意圖［32］。均勻電紡是在CS(0.5 ml/h)與PCL(1 ml/h)穩(wěn)定流速下進(jìn)行，梯度電紡在質(zhì)量梯度流速(CS:0～0.5 ml/h，PCL:0～1 ml/h)下進(jìn)行，由于肝素和VEGF負(fù)載于殼聚糖，因此，梯度電紡更有利于血管內(nèi)壁抗凝血和快速誘導(dǎo)內(nèi)皮化。

袁曉燕與孔德領(lǐng)兩個(gè)課題組合作，通過同軸共紡，以血小板衍生生長因子(PDGF-bb)與葡聚糖(DEX)為芯層，以PLCL為殼層，研究了血管平滑肌細(xì)胞在多孔纖維膜上的粘附、增殖和細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，負(fù)載PDGF-bb的多孔纖維膜材料能促進(jìn)細(xì)胞粘附，其細(xì)胞活性也顯著提高［33］。

4.2 NO原位控制釋放

內(nèi)皮細(xì)胞通過NO合成酶(NOS)氧化L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮(NO)，對(duì)心血管系統(tǒng)的生理與功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。從內(nèi)皮細(xì)胞表面持續(xù)釋放的NO能夠有效地防止血小板在正常血管壁上的粘附和活化，能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及促進(jìn)傷口愈合，有助于減少血管再狹窄。由于NO分子對(duì)心血管系統(tǒng)的重要性，近年來人們嘗試各種方法制備可釋放NO的生物材料。這些方法包括:①將NO供體作為分散的分子摻入聚合物材料或者共價(jià)連接到聚合物骨架上，形成了早期的NO釋放材料，可用于制備成皮下植入或透皮給藥的固體膜或凝膠以及其它醫(yī)學(xué)裝置的包衣材料。優(yōu)點(diǎn)是可以通過改變聚合物基質(zhì)或NO供體結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)NO釋放速率，增加這些包衣材料或醫(yī)學(xué)裝置的效率并延長其使用周期［34－35］;② 先制備NO供體衍生物，再將這些衍生物加入不同的聚合物基質(zhì)中，通過調(diào)整聚合物基質(zhì)比例以及種類控制NO的釋放速率［36－37］;③ 前面兩種方法只有固定的NO儲(chǔ)存量，不能保持持續(xù)、長期的NO釋放。人體內(nèi)存在著S-亞硝基硫醇類和亞硝酸鹽等內(nèi)源性的可釋放NO的物質(zhì)。內(nèi)源性NO在體內(nèi)多與蛋白質(zhì)連接，如S-亞硝基蛋白(AblSNO)，其可以與低分子的硫醇(RSHs)如L-半胱氨酸(Cys)之間發(fā)生快速的亞硝基轉(zhuǎn)換反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后得到的CysNO在體內(nèi)是不穩(wěn)定的，可快速釋放NO。因此，可將諸如L-半胱氨酸或包含L-半胱氨酸的復(fù)合物固定在材料表面或者將還原劑以及NO前體混合進(jìn)聚合物基質(zhì)中，利用上述的反應(yīng)來釋放NO，發(fā)揮其生物活性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是利用體內(nèi)存在的NO供體，保證長期穩(wěn)定的NO供給，NO的釋放也是發(fā)生在材料的植入部位［38］。

圖16 血管組織工程支架梯度電紡與均勻電紡示意圖Fig.16 Schematic diagram of gradient and uniform nano-fibrous scaffolds for vascular tissue engineering

作者實(shí)驗(yàn)室直接將NO供體分子混合到PCL溶液中，制備靜電紡絲支架。發(fā)現(xiàn)NO突釋現(xiàn)象和材料的細(xì)胞毒性明顯。采用芯殼結(jié)構(gòu)的靜電紡絲技術(shù)，NO供體分子包埋在纖維的內(nèi)芯，使NO突釋和材料的細(xì)胞毒性得到了一定程度的改善［39］。芯殼結(jié)構(gòu)材料上培養(yǎng)的細(xì)胞活性明顯高于非芯殼結(jié)構(gòu)的材料，接近于純PCL支架。NO釋放材料表面的血小板粘附顯著低于PCL材料(圖17［39］)，說明NO的釋放有效地抑制了血小板的粘附。

圖17 材料表面粘附血小板的SEM照片:(a)單純PCL紡絲膜，(b)負(fù)載NO供體分子的PCL紡絲膜Fig.17 SEM micrographs of adhered platelets on control electro-spun film:(a)pure PCL electro-spun film and(b)PCL electro-spun film with supplier loaded NO moleculars

最近，作者實(shí)驗(yàn)室合成了半乳糖基修飾的NO供體分子，利用半乳糖基團(tuán)穩(wěn)定NO供體分子，同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶催化控制NO的釋放。該NO供體分子在儲(chǔ)存條件下很穩(wěn)定，不被空氣和水分解，只有在半乳糖苷酶存在的條件下NO才能釋放。將這種新型NO供體分子結(jié)合到靜電紡絲血管支架材料中，構(gòu)成了酶催化NO釋放血管材料。由于人體內(nèi)含有這種半乳糖苷酶，因此，可以預(yù)見這種新的NO釋放材料，可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用

基因治療手段常在組織工程中用于提高生長因子和酶的表達(dá)，加快組織的形成?；蛑委熗Ｍ虮磉_(dá)發(fā)生在病灶部位，而不是全身和系統(tǒng)表達(dá)。針對(duì)這一特點(diǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道了多種支架材料介導(dǎo)的基因投遞體系。如將基因載體與DNA的復(fù)合物納米粒子固定到材料表面［40］，這類支架材料介導(dǎo)的非病毒基因轉(zhuǎn)染體系主要是提高了細(xì)胞對(duì)DNA納米復(fù)合物的攝取率，因而顯著提高了轉(zhuǎn)染效率。張琳華等將抗DNA抗體通過化學(xué)鍵結(jié)合到血管支架表面，進(jìn)而固定質(zhì)粒DNA，并應(yīng)用治療豬動(dòng)脈再狹窄，顯示出支架局部基因轉(zhuǎn)染與表達(dá)［41］。

作者實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用了一種不同的方法將DNA固定到電紡絲纖維材料表面。首先將PEG修飾的非病毒載體PEI與PCL溶液混合，制備復(fù)合的靜電紡絲支架，再將DNA通過DNA-PEI的相互作用吸附到材料表面。采用PEG修飾的PEI的目的是改善PEI的細(xì)胞相容性，并降低PEI在基因轉(zhuǎn)染中的血清抑制作用。當(dāng)基因載體分子PEI-PEG從纖維中釋放時(shí)，與纖維表面吸附的DNA結(jié)合，形成PEI-PEG/DNA納米復(fù)合物，粒徑約200 nm。圖18是PEI-PEG/DNA在溶液中和在纖維支架上顆粒尺寸的分布，圖19是其在溶液中和在纖維支架上形成的顆粒的 TEM 照片［42］。

5 結(jié)語

人工血管需要同時(shí)解決抗凝血、促內(nèi)皮細(xì)胞生長和平滑肌再生的問題。血管內(nèi)皮和平滑肌都有復(fù)雜的生物學(xué)特性，人工血管的研究涉及多學(xué)科的交叉。在材料方面，應(yīng)重點(diǎn)開展新材料、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、功能修飾、降解問題、新制備工藝等內(nèi)容。同時(shí)，應(yīng)從分子和細(xì)胞水平研究材料與心血管系統(tǒng)的生物應(yīng)答，探討材料學(xué)因素對(duì)心血管組織修復(fù)的影響。

人工血管的研究不單是材料制備的問題，生理和病理等各種生物學(xué)因素直接影響材料的植入效果和轉(zhuǎn)歸。因此，需要在心血管生物學(xué)方面深入研究巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)傳導(dǎo)及其他生物學(xué)機(jī)制。在心血管生理病理方面深入研究內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的生理與功能，研究二者在疾病狀態(tài)下的損傷、修復(fù)與再生過程的信號(hào)傳導(dǎo)與干預(yù)機(jī)制。

此外，深入系統(tǒng)地開展心血管生物材料基礎(chǔ)研究，需要多學(xué)科交叉和研究團(tuán)隊(duì)建設(shè)，這是解決人工血管研究的復(fù)雜問題和加速該研究方向產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的關(guān)鍵。

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The Development of Construction of Small-Diameter Vascular Grafts in Vivo

WANG Shufang，ZHENG Wenting，KONG Deling
(State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology，College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Although there is a growing demand of small-diameter vascular grafts for cardiovascular disease，the incidence rate of restenosis caused by vascular grafts remains high.An effective approach to improve the function of small-diameter vascular grafts and realize the blood vessel regeneration would be to induce a healing response in vivo for tissue engineering.In this article，we summarize the recent research developments on small-diameter vascular grafts，and highlight the main designing ideas and research outcomes in our laboratory.The work includes structural design and fabrication of porous scaffolds，anti-clotting modification，functionalization for endothelial progenitor cells(EPCs)capture，creation of micro-environment for vascular smooth muscle regeneration and angiogenesis.Some directions and problems on future research in these areas are also discussed.

vascular grafts;tissue engineering;scaffold preparation;stem cell capture;endothelialization;smooth muscle regeneration;extracellular microenvironments

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0006－14

2012－04－23

國家973研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB964903，2012CB725203);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50830104，51073081，81000680)

王淑芳，女，1963年生，教授，博士生導(dǎo)師

孔德領(lǐng)，男，1966年生，教授，博士生導(dǎo)師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.02