雙綠5號(hào)蠶豆根瘤菌的分離及其包衣處理的效果

陳小央

(勿忘農(nóng)集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 310020)

研究結(jié)果表明，接種根瘤菌可以顯著地提高蠶豆的產(chǎn)量，增加土壤肥力［1-5］。因此，對(duì)浙江省主栽的蠶豆新品種雙綠5號(hào)［6］進(jìn)行根瘤菌有效共生匹配篩選，開(kāi)展蠶豆種子包衣技術(shù)試驗(yàn)，對(duì)包衣效果進(jìn)行初步比較，以期為蠶豆種子包衣商品化提供技術(shù)支持，進(jìn)而提高蠶豆種子質(zhì)量，加快雙綠5號(hào)種子的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

雙綠5號(hào)蠶豆種子由本公司生產(chǎn)。

根瘤菌培養(yǎng)基 (YMA):甘露醇10 g，酵母粉1 g，土壤浸出液200 mL，調(diào)整pH值為7.2，加入瓊脂粉 20 g，補(bǔ)足水至 1 000 mL。121℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆根瘤菌的分離與純化

菌種來(lái)源取自于雙綠5號(hào)蠶豆高產(chǎn)區(qū)蕭山農(nóng)業(yè)對(duì)外綜合開(kāi)發(fā)區(qū)17工段農(nóng)場(chǎng)，選擇健壯株開(kāi)花后結(jié)莢前拔取5株，檢查根瘤菌，挑選色鮮飽滿的根瘤進(jìn)行分離。先用無(wú)菌水清理根瘤表面污泥，接著在75%酒精中清洗浸泡1 min，然后用升汞消毒根瘤表面，最后分別用75%酒精和無(wú)菌水清洗2遍，壓碎根瘤，用接種針蘸取瘤液在YMA平板上進(jìn)行劃線分離，30℃培養(yǎng)2 d。挑取無(wú)色半透明粘稠的單菌落進(jìn)行純化，純化方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1，7］。

1.2.2 蠶豆根瘤菌回接菌株培養(yǎng)

將供試菌株先接到Y(jié)MA斜面活化，然后轉(zhuǎn)接于裝有YMA液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，30℃過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用平板法檢測(cè)含菌量為1億·mL-1。

滅菌處理。將試驗(yàn)所需用的鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、玻璃棒包好，在121℃下滅菌30 min。分別稱取75 g蛭石裝入塞有紗布條的塑料杯中，在下層的玻璃瓶中注入50 mL蒸餾水，將裝有蛭石的塑料杯置于玻璃瓶上，再用牛皮紙包扎好，將其放入高壓鍋中間歇滅菌3 h，溫度為121℃ 。

蛭石栽培及接種。雙層缽法:將4粒正常萌發(fā)一致，根長(zhǎng)1 cm左右的蠶豆種子置于發(fā)酵好的根瘤菌液中，浸泡15 min(以淹沒(méi)種子為宜)，用無(wú)菌鑷子夾取其植入裝有無(wú)菌蛭石的塑料杯中，每杯種植1粒，再沿各種子根部加入該菌液2 mL。在底層的供水瓶中裝入低氮營(yíng)養(yǎng)液 (液面不能高于上層缽底部)，用牛皮紙封口 (所用材料均提前滅菌)，同時(shí)在牛皮紙中間剪一小洞 (直徑約1 cm)。同時(shí)設(shè)不浸泡接種根瘤菌的為對(duì)照，以上步驟均在超凈臺(tái)上進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度為6 000～10 000 lx，晝夜溫度為 (25±5)℃，日照時(shí)數(shù)14 h的日光室中培養(yǎng)。待蠶豆生長(zhǎng)35 d后收取。收取時(shí)用水沖洗凈根，分別測(cè)定每株蠶豆的有效根瘤數(shù) (以呈現(xiàn)粉紅色為標(biāo)準(zhǔn))、鮮瘤重、植株地上部干物重。

1.2.3 根瘤菌種衣劑不同藥種比較

將發(fā)酵液為主要成分，按照重量百分比與成膜劑配制成根瘤菌種衣劑，每處理稱取雙綠5號(hào)蠶豆種子 2 kg，按藥種比 1∶20，1∶35，1∶50 和 1∶70 分別折算種衣劑藥液重量，置于密封容器內(nèi)搖勻后，在通風(fēng)良好的室內(nèi)自然晾干，溫度為 (27±2)℃，相對(duì)濕度約70%，觀察種子包裹效果，從每個(gè)處理的種子中隨機(jī)取出200粒，用目測(cè)法觀察包衣完整度。4～14 d測(cè)定發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，測(cè)定方法GB/T 3543.4—1995紙間法進(jìn)行，4次重復(fù)，每處理100粒，結(jié)果進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)。余下的種子播種進(jìn)行田間試驗(yàn)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積3.33 m2，4次重復(fù)，四周設(shè)保護(hù)行，株距25 cm，行距100 cm，每穴播1粒。播后30 d，檢查成苗率，開(kāi)花時(shí)檢查根瘤數(shù)，收獲后考查產(chǎn)量。

1.2.4 根瘤菌種衣劑包衣種子貯藏比較

6月收獲雙綠5號(hào)蠶豆種子，將種子按藥種比1∶35包衣好，自然晾干到水分符合國(guó)標(biāo) GB 4401.2—1996，用未包衣種子作對(duì)照。采用塑料袋密封包裝，在種子倉(cāng)庫(kù)常溫下保存，分別于密封后15，30，60，90和120 d測(cè)定其發(fā)芽率，觀察種子發(fā)芽力情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌的分離與純化

從蠶豆新鮮株根系上分離到根瘤菌純化株1株R，在YMA平板上為無(wú)色半透明粘稠的圓形單菌落，隆起，表面光滑，有莢膜。

2.2 根瘤菌回接效果

將菌株R用雙層缽培養(yǎng)法培養(yǎng)，結(jié)果結(jié)瘤數(shù)(平均每株62.5個(gè))顯著高于不接菌對(duì)照，鮮瘤重也明顯高于對(duì)照，證明分離的菌株R能有效侵染雙綠5號(hào)蠶豆根系，而且對(duì)蠶豆地上部分干物質(zhì)積累的增加有顯著作用，與不接種的對(duì)照相比對(duì)莖葉干物質(zhì)積累增加97.5%(表1)。

表1 根瘤菌回接處理的效果

2.3 根瘤菌種衣劑不同藥種比包衣種子效果

由表2可知，不同包衣藥種比對(duì)蠶豆種子的包衣處理效果差異明顯，除 1∶70外，1∶20，1∶35，1∶50包衣完整度81% ～90%。發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)除了1∶20低于對(duì)照外，其余藥種比均高對(duì)照或相等。

表2 種衣劑不同藥種比處理的發(fā)芽情況

從表3結(jié)果可看出，在1∶20的藥種比時(shí)成苗率受到較大影響，根瘤數(shù)隨著藥種比的減少而減少，但均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不包衣對(duì)照。包衣的處理有效分枝數(shù)、單株結(jié)莢數(shù)和鮮莢產(chǎn)量均高出不包衣對(duì)照，但鮮莢產(chǎn)量以藥種比1∶35的最高，顯著高于不包衣對(duì)照。

表3 根瘤菌種衣劑不同藥種比處理的效果

2.4 根瘤菌種衣劑包衣種子貯藏效果

從表4結(jié)果說(shuō)明，用根瘤菌包衣雙綠5號(hào)種子進(jìn)行一個(gè)常溫貯藏周期 (從收獲到播種)120 d，對(duì)發(fā)芽力沒(méi)有劣變的影響。

表4 根瘤菌種衣劑包衣種子不同貯存時(shí)間對(duì)發(fā)芽率的影響

3 小結(jié)與討論

根瘤菌對(duì)于蠶豆生產(chǎn)具有顯著的增產(chǎn)作用，可大大減少田間化肥用量，省工省本，對(duì)提高產(chǎn)品品質(zhì)，降低環(huán)境污染具有重要意義。本試驗(yàn)中純化的R菌株分離自雙綠5號(hào)蠶豆生長(zhǎng)株根系根瘤，與雙綠5號(hào)蠶豆有很好的共生匹配性，可以作為生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的菌株。

雙綠5號(hào)蠶豆為大粒型圓扁形蠶豆，包衣時(shí)種子轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，難度較大。為了達(dá)到包衣效果與成本兼顧的目的，種子包衣的藥種比以1∶35較為合適，若減少藥種比，提高包衣濃度，雖然能提高包衣均勻度和完整度，但會(huì)明顯增加包衣厚度，成本增加，又影響出苗，主要表現(xiàn)為根的正常生長(zhǎng)受到抑制;而增加藥種比，降低包衣濃度，則使包衣不完整均勻，又影響菌肥效果。

根瘤菌包衣種子貯藏試驗(yàn)結(jié)果表明，從當(dāng)年6月蠶豆種子收獲，到9-10月播種，按1∶35的藥種比包衣處理，對(duì)發(fā)芽和田間成苗沒(méi)有明顯影響。但要注意包衣后種子包裝貯藏前水分必須在GB 4401.2—1996規(guī)定的范圍內(nèi)，即≤12%，否則會(huì)對(duì)發(fā)芽成苗產(chǎn)生不良影響。

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