田口試驗設(shè)計法優(yōu)選靈芝多糖脂質(zhì)體的制備工藝

陳中文

田口試驗設(shè)計法優(yōu)選靈芝多糖脂質(zhì)體的制備工藝

陳中文

（廣東省肇慶市端州區(qū)華佗醫(yī)院，肇慶 526040）

優(yōu)選靈芝多糖脂質(zhì)體的最佳工藝。采用薄膜分散-微孔濾膜擠壓法制備靈芝多糖脂質(zhì)體，運用田口試驗設(shè)計法以載藥量的信噪比（S/N）作為指標(biāo)，對脂藥比、膜材比和超聲時間等制備條件進行優(yōu)選。薄膜分散-微孔濾膜擠壓法制備靈芝多糖脂質(zhì)體的最佳工藝為脂藥比10:1，膜材比8:1，超聲時間20min，水化溫度為50℃。采用最佳制備工藝制作的靈芝多糖脂質(zhì)體載藥量較高。

靈芝多糖脂質(zhì)體；薄膜分散-微孔濾膜擠壓法；田口試驗

靈芝[Ganoderma alucidum（Leyss. ex Fr.）Karst.]是擔(dān)子菌綱多孔科靈芝屬真菌，有赤芝、紫芝、白芝等品種，其中赤芝是最常用的靈芝屬真菌之一，是我國傳統(tǒng)的補益藥，具有滋補壯身、扶正固本、延年益壽之功效?，F(xiàn)代研究表明[1-3]，靈芝多糖有廣泛的藥理活性，能提高機體免疫力和耐缺氧能力，消除自由基，抑制腫瘤、抗輻射，提高肝臟、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白質(zhì)能力，還具有刺激宿主非特異性抗性、免疫特異反應(yīng)以及抑制移植腫瘤生理活性的特性。目前大多數(shù)靈芝多糖制劑在使用過程中，藥物在達到作用部位之前已經(jīng)被降解代謝，因此需要大劑量給藥或是連續(xù)給藥。脂質(zhì)體具有靶向釋藥、緩釋、無免疫原性、降低藥物不良反應(yīng)等優(yōu)勢，可以作為靈芝多糖的高效載體以提高治療效果并降低使用劑量[4-7]。本研究采用田口試驗設(shè)計法，以載藥量的信噪比（S/N）作為指標(biāo)，考察各因素對制備工藝的影響，優(yōu)化靈芝多糖脂質(zhì)體的制備工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Model RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生物儀器有限公司）；UV24802型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；SB3200超聲波清洗器（上海新芝生物技術(shù)研究所）；Model H-7650型透射電子顯微鏡（Hitachi，High-Technologies 公司）。

1.2 試劑 靈芝多糖（陜西永源有限公司）；大豆卵磷脂（上海太偉磷脂有限公司）；膽固醇（天津市博迪化學(xué)有限公司）；魚精蛋白（Sigma公司）；Triton-100（廣州恒滔貿(mào)易有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 田口試驗設(shè)計 在預(yù)試驗中，發(fā)現(xiàn)卵磷脂與藥物質(zhì)量比（脂藥比）、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比（膜材比）和超聲時間對靈芝多糖脂質(zhì)體質(zhì)量的影響較大，因此以脂藥比（A）、膜材比（B）和超聲時間（C）為考察因素，分別擬定3水平，按L9（34）正交設(shè)計表進行試驗，因素水平見表1。

表1 試驗因素水平

2.2 靈芝多糖脂質(zhì)體的制備[8-9]將膽固醇、大豆卵磷脂、維生素E（0.025g）溶解于乙醇-氯仿（1:1）中，混勻后倒入梨形瓶，以30r?min-1水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，使其在梨形瓶壁上形成干膜。將靈芝多糖溶解在PBS溶液中（靈芝多糖用量為50mg），再將靈芝多糖溶液倒入梨形瓶中，在水浴條件下，以30r?min-1旋轉(zhuǎn)水化至瓶壁上的干膜完全洗脫下來為止。將所得液體在一定溫度下水化1h，然后水浴超聲。將所得混懸液過0.8μm微孔濾膜1次，0.45μm微孔濾膜3次，0.22μm微孔濾膜3次，即得靈芝多糖脂質(zhì)體混懸液。

2.3 靈芝多糖脂質(zhì)體載藥量的測定[10-11]吸取0.5ml脂質(zhì)體于10ml離心管中，添加0.5ml魚精蛋白（10mg?mL-1），攪拌均勻，靜置5min，加入生理鹽水3ml，25℃3000r?min-1離心30min，取上清液定容至10ml。取1ml溶液，測游離的靈芝多糖含量。沉淀用10% Triton-100 3ml溶解，并用生理鹽水定容至10ml。取1ml溶液，測定其靈芝多糖含量，即包封的藥物含量。載藥量可按下式計算：載藥量=（脂質(zhì)體溶液中多糖含量-游離多糖含量）/卵磷脂與膽固醇質(zhì)量之和。

2.4 靈芝多糖脂質(zhì)體中多糖的測定[12]

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取0.1mg?mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100、150、200、250、300、350、400μl，各加純水至500μl。以純水500μl為空白，各加入5%苯酚溶液300μl和濃硫酸1.5ml，搖勻，室溫放置10min后沸水浴加熱20min，冰水浴中冷卻至室溫后于490nm波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度對吸光度進行線性回歸，得到回歸方程A=0.0159C-0.0029，r=0.9998，表明葡萄糖在0.05～0.35mg?ml-1之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 樣品測定 精密吸取脂質(zhì)體溶液1ml，加蒸餾水2ml，按上述方法測定吸光度，將吸光度求平均值后代入回歸方程中，計算，即得樣品濃度。

2.5 結(jié)果與分析[13]Taguchi方法根據(jù)對試驗中質(zhì)量特性值要求的數(shù)值范圍不同，分為望目值、望大值和望小值，其中望大值是希望質(zhì)量特性值越大越好，波動程度越小越好。而在實驗中，影響質(zhì)量特性波動原因的因素主要可以分為可控因素和不可控因素。可控因素主要是能在試驗中人為加以控制的因素，如脂藥比、膜材比和超聲時間等；不可控因素主要是在試驗中事先設(shè)定或較難控制的因素，如標(biāo)示因素、誤差因素等。本實驗中主要關(guān)注可控影響因素對載藥量的影響。

Taguchi方法能夠充分利用系統(tǒng)中存在的非線性效應(yīng)，通過選取適當(dāng)?shù)恼辉O(shè)計表安排實驗，然后通過對實驗結(jié)果進行信噪比和方差分析確定各因素的最有條件以及影響顯著性程度。本實驗選用L9（34）正交設(shè)計表進行實驗，結(jié)果見表2，其中，S/N為信噪比，信噪比計算公式如下：

其中，yi為載藥量，yd為預(yù)測載藥量，本實驗取望大值，即S/N數(shù)值越大越好。

表2 田口實驗數(shù)據(jù)計算

由于Taguchi方法中，S/N值最大的水平為最優(yōu)水平，因此通過算術(shù)平均方法求出各個因素在不同水平上的平均S/N值，并以圖的形式給出了各因素隨不同水平的變化趨勢（見圖1）。由圖可得，A因素的1號水平，B因素的3號水平，C因素的2號水平，D因素的3號水平為各因素的最佳水平。

圖1 各因素在不同水平的S/N變化圖

通過S/N值方差分析考察各因素對載藥量影響的顯著性，方法分析結(jié)果見表3，F(xiàn)值是各因素影響顯著性的重要指標(biāo)，F(xiàn)值越大，說明該因素影響越顯著。此外，純平方和在總平方和中所占的比率成為貢獻率，也可以用來估計各因素的影響程度。

表3 方差分析

由表3可知，因素A影響最顯著，B、C、D影響較小，即靈芝多糖脂質(zhì)體載藥量受脂藥比影響遠大于其他因素。

通過上述結(jié)果，故選用A因素的1號水平，B因素的3號水平，C因素的2號水平，D因素的3號水平。采用design expert7.1軟件預(yù)測了各因素在A1B3C2D3條件下信噪比值S/N為11.4652，將此式代入公式計算，可得靈芝多糖脂質(zhì)體載藥量的最大預(yù)測值為0.505。

2.6 結(jié)果驗證 按照上述最佳工藝條件制備3批靈芝多糖脂質(zhì)體，進行質(zhì)量評價，結(jié)果所制的脂質(zhì)體為多層囊狀或多層圓球體，平均粒徑1.23μm，多分散性系數(shù)0.5156，平均包封率81.15 %，平均載藥量為0.495。

3 討論

田口試驗設(shè)計是利用正交表挑選實驗條件、安排設(shè)計的方法。其設(shè)計過程分為三個階段，即系統(tǒng)設(shè)計、參數(shù)設(shè)計和容差設(shè)計。其重點是參數(shù)設(shè)計，而參數(shù)設(shè)計的重點是穩(wěn)定性設(shè)計。常采用信噪比作為衡量穩(wěn)定性好壞的指標(biāo)。該試驗設(shè)計方法的優(yōu)點是成功運用以信噪比作為質(zhì)量評價指標(biāo)，以尋求最優(yōu)的穩(wěn)定性好的參數(shù)組合，并能對最佳組合進行預(yù)測。

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Preparation Condition Optimization of Ganoderma Lucidum Polysaccharides liposome with Taguchi Methodology

Chen Zhongwen

Huatuo hospital of DuanZhou in Zhaoqing city, Guangdong province 526040, China

To optimize the preparation conditions of Ganoderma lucidum polysaccharides liposome (GLPS).GLPS liposome was prepared by membrane distribution-micromembrane extruding method. Taguchi Methodology was adopted to optimize the preparation conditions which was designed with lecithin to drug ratio, lecithin to cholesterol ratio, and ultrasonic time, and the indexes of the drug-loading rate’s Signal-to-noise ratio (S/N).The optimized preparation conditions were as follows: the ratio of lecithin to drug was 10:1, the ratio of lecithin to cholesterol was 8:1, the ultrasonic time was 20 min, the hydration temperature was 50℃.The GLPS liposome prepared under the optimized conditions has high drug-loading rate.

GLPS liposome; Membrane distribution-micromembrane extruding method; Taguchi Methodology

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.01-094

1672-2779（2012）-01-0051-03

（本文校對：鄺寧鋒 收稿日期：2011-11-28）