醋酸鉛對雄性小鼠附睪Y染色體基因Ddx3y蛋白表達的影響

于麗萍，程繁銀，李亞晨，樸豐源

(1.大連大學 附屬中山醫(yī)院 內科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學 衛(wèi)生管理學教研室，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學 勞動衛(wèi)生與環(huán)境學教研室，遼寧 大連 116044)

鉛是一種常見的有毒重金屬和環(huán)境污染物。隨著經(jīng)濟快速發(fā)展，環(huán)境鉛污染問題日趨嚴重。鉛具有多系統(tǒng)毒性，尤其男性生殖毒性已引起關注。人群流行病學調查和動物實驗研究表明，鉛暴露不僅對精子的發(fā)生，而且對精子的發(fā)育和成熟均具有明顯的抑制作用[1-2]，但其毒作用機理目前尚不十分清楚。

附睪是精子貯藏、成熟的場所。由睪丸上皮生成的精子只有通過附睪后才獲得向前運動能力和受精能力，即達生理上的成熟[3]。本研究用組織病理學技術并結合Western blotting、免疫組化的方法，觀察鉛對雄性小鼠附睪組織Y染色體基因Ddx3y蛋白的表達影響，探討該蛋白與鉛的生殖毒性作用之間的關系，為闡明鉛的雄性生殖毒性機制以及防治鉛的生殖毒性危害提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試 劑

醋酸鉛(上?；瘜W試劑廠)；RIPA強裂解液(碧云天生物技術研究所)；一抗為小鼠單克隆抗體(美國SANTA CRUS公司)；二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(美國Sigma公司)；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 動物的選擇和飼養(yǎng)

健康昆明種雄性小鼠48只，體重(20±2) g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按體重將小鼠隨機分為4組，每組12只。即對照組、0.5 g/L醋酸鉛染毒組、1 g/L醋酸鉛染毒組和1.5 g/L 醋酸鉛染毒組。飼養(yǎng)小鼠的室內條件如室溫(22±2) ℃、濕度(60±5) %等被嚴格監(jiān)控，小鼠可以任意飲水和取食(標準食物)，連續(xù)染毒60 d。

1.3 組織形態(tài)學觀察

取附睪組織，經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下進行組織形態(tài)學觀察。

1.4 Western blotting測定Ddx3y蛋白表達

將附睪組織在液氮中研磨，組織勻漿器勻漿，用RIPA強裂解液(碧云天生物有限公司)4 ℃裂解細胞30 min，在使用前數(shù)分鐘加入PMSF，13 000 r 20 min離心提取組織總蛋白, BCA試劑盒對蛋白進行定量，β-actin作為內參，蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，電泳結束后濕式轉膜20 min，抗體結合，ECL顯色發(fā)光，UVP掃描分析。一抗為小鼠單克隆抗體(美國SANTA CRUS公司，sc-11023)，稀釋度為1∶1500 (v/v)，β-actin一抗為鼠抗鼠單克隆抗體(美國Sigma公司)，稀釋度為1∶1500 (v/v)。二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(美國Sigma公司),稀釋度為1∶5000(v/v)。

1.5 免疫組織化學方法觀察附睪組織

將切片放入裝有抗原修復液的容器中，至微波爐加熱，使容器內液體溫度保持在92～98 ℃，并持續(xù)10～15 min。5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min。傾去血清，滴加一抗為小鼠單克隆抗體，稀釋度為1∶80 (v/v)，37 ℃烤箱2 h。PBS漂洗后，滴加二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃烤箱10 min。滴加DAB顯色液顯色10 min，自來水充分漂洗，蘇木素復染1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，進行圖像采集。

1.6 統(tǒng)計學方法

計量資料結果用均數(shù)±標準差形式表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和組間比較采用SNK-q檢驗法分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 附睪組織病理學觀察

對照組可見附睪管中位于基膜上的一行排列整齊的小圓形細胞核的基細胞，附睪管結構完整，內含大量精子和分泌液(圖1A)。而染鉛組附睪管內精子數(shù)和分泌液均減少，尤其 1.5 g/L染鉛組最為明顯(圖1D)。

圖1 小鼠附睪組織形態(tài)學變化(HE染色)Fig 1 Morphological changes in the epididymis of mice (HE staining)A為對照組；B為0.5 g/L 染鉛組；C為1.0 g/L 染鉛組；D為1.5 g/L染鉛組sp: sperms； pc: principal cells； L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

2.2 醋酸鉛對附睪組織Ddx3y蛋白表達影響

Western blotting檢測結果顯示，醋酸鉛染毒組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達顯著低于對照組，并隨染鉛劑量的增加而降低，其中1.5 g/L染鉛組Ddx3y蛋白表達量降低最為明顯(P<0.01)。β-actin作為內參(圖2、圖3)。

2.3 附睪組織的免疫組織化學觀察

附睪免疫組化結果顯示，抗Ddx3y蛋白免疫反應陽性細胞均呈棕黃色，免疫反應特異性產物主要分布在基細胞胞核周圍，各組均可見輸精管中有少量精子。染鉛組可見，隨著染鉛劑量的增加，抗Ddx3y蛋白免疫反應強度逐漸降低(圖3)。

3 討 論

Telisman[4]對101名接鉛工人進行調查，發(fā)現(xiàn)血鉛與精液量、精子密度、精子活力和精子活率呈明顯負相關。Wadi等[5]用含不同濃度鉛的飲水飼養(yǎng)雄性成熟小鼠6周，結果顯示鉛暴露組附睪內精子數(shù)量明顯減少，精子數(shù)量和活動精子所占比例降低。本實驗結果表明，染鉛組附睪管內精子數(shù)顯著低于對照組，與上述流行病學調查和動物實驗結果一致，提示鉛暴露對精子的發(fā)育、成熟均具有明顯的抑制作用。

圖2 各劑量組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達結果Fig 2 Expression of Ddx3y protein in the epididymis of mice

圖3 Ddx3y蛋白在附睪組織的表達分布Fig 3 Distribution of Ddx3y protein expression in the epididymis of miceA為對照組；B為0.5 g/L 染鉛組；C為1.0 g/L 染鉛組；D為1.5 g/L 染鉛組sp: sperms; pc: principal cells; L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

長期以來，Y染色體一直是男性不育遺傳因素的重點研究對象。1996年Vogt等將Y染色體長臂上主導精子形成的區(qū)域分為AZFa、AZFb、AZFc區(qū)。AZFa區(qū)包含3個基因，DDX3Y (DBY)、USP9Y和UTY[6],目前認為DDX3Y為與男性不育有關的主要候選基因。小鼠也有與人的Y染色體同源基因Ddx3y，位于Y染色體斷臂(Yp)Sxrb區(qū)間[7]。小鼠Ddx3y編碼的蛋白參與雄性生殖功能，與人類DDX3Y編碼的蛋白具有高度同源性[8]。本實驗的Western blotting和免疫組織化學檢測結果均顯示，染鉛組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達顯著下調，且具有劑量-反應關系，表明鉛對小鼠附睪組織Ddx3y蛋白表達具有明顯的抑制作用。這些結果提示，抑制附睪組織Ddx3y蛋白表達可能與鉛誘導雄性生殖毒性作用有關。今后，有必要從mRNA水平驗證鉛對Ddx3y表達的影響及深入探討Ddx3y蛋白表達下調與鉛的雄性生殖毒性作用之間的內在聯(lián)系。

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