組織工程用納米纖維支架制備方法的進(jìn)展

劉淑瓊 許禎毅

（1.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程系，福建 武夷山 354300；2.武夷山市質(zhì)量計(jì)量檢測所，福建 武夷山 354300）

前言

組織工程(tissue engineering)是用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理及技術(shù)，構(gòu)建、培育活組織，研制生物替代品以修復(fù)或重建組織器官的結(jié)構(gòu)，維持或改善組織器官功能的一門新興的邊緣學(xué)科[1]。它包括三大要素：支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子。支架材料在組織工程中起重要作用，因?yàn)橘N壁依賴型細(xì)胞只有在材料上黏附后，才能增殖、生長和分化，而細(xì)胞的增殖、生長和分化則是組織形成的必經(jīng)過程，很多文獻(xiàn)都證明了納米纖維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的這一系列行為有著重要的影響[2]。作為支架材料應(yīng)具備有以下性能[3－5]：(1)材料應(yīng)在結(jié)構(gòu)和功能上與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似，具有良好的生物相容性；(2)良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性；(3)可降解性；(4)具有三維立體結(jié)構(gòu)，孔徑的大小要與細(xì)胞體積相一致；(5)易于塑型性和有一定的機(jī)械強(qiáng)度；(6)具有負(fù)荷最大量細(xì)胞的高滲透性；(7)可與其他活性分子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)移生長因子－p(TGF－p)復(fù)合共同誘導(dǎo)骨發(fā)生。其中高孔隙率的聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可保證支架內(nèi)細(xì)胞和周圍宿主組織間正常的物質(zhì)運(yùn)輸，并為毛細(xì)血管的長入提供空間。而納米纖維材料因具有高的比表面積、高孔隙率、高的表面能、小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，及與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可以為細(xì)胞在體外的生長、發(fā)育和細(xì)胞間通訊提供理想的微環(huán)境。因此，模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的結(jié)構(gòu)制成的含納米纖維的生物可降解材料，將在組織工程中具有良好的應(yīng)用前景，成為組織工程支架材料的一個(gè)新的研究方向。

目前，有很多不同的制備技術(shù)可以用來制備聚合物納米纖維，這些方法各式各樣，包括物理的、化學(xué)的、熱力學(xué)的以及靜電作用的等制備技術(shù)[6－8]。本文就納米纖維的各種制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)做一綜述如下，并將其優(yōu)缺點(diǎn)歸納如表1。

1 納米纖維制備方法

1.1 靜電紡絲

靜電紡絲是一種用來制備超細(xì)纖維的技術(shù)，其纖維大小包括微纖維(＞1mm)和納米纖維(＜1000 nm)[9]，制備裝置如圖1所示。其原理就是向聚合物溶液或熔體提供一個(gè)高壓，使其克服表面張力形成一股帶電射流，聚合物溶液或熔體經(jīng)過噴射，在接地接收板上進(jìn)行收集、干燥、固化。聚合物溶液或熔體噴出到接受板的過程中，射流就存在相互排斥的作用，所以在溶劑揮發(fā)后就形成細(xì)纖維。因此，通過控制紡絲條件就可以獲得直徑大小為0.02-20μm的纖維。當(dāng)接受板靜止不動(dòng)時(shí)，得到的纖維就會(huì)因?yàn)榫酆衔镬o紡溶液的隨機(jī)移動(dòng)而堆積沉積在接受板上。然而，如果用接地電的轉(zhuǎn)筒作為收集器，那就可以得到取向的纖維[10]。

已有較多的材料通過靜紡形成納米纖維應(yīng)用于組織再生支架[11,12]。應(yīng)用于靜電紡絲的材料有天然材料包括膠原、殼聚糖和蠶絲蛋白等、合成可生物降解的材料有PGA、PLGA、PLLA和PCL等及二者的復(fù)合物[11,13-15]。另外，像生長因子、蛋白質(zhì)和羥基磷灰石等生物活性物質(zhì)也可在靜電紡絲中復(fù)合到納米纖維材料中[15,16]。因此，靜電紡絲納米纖維生物材料已開始被設(shè)計(jì)成各種組織。但是，采用該技術(shù)制備成具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)或者是形成理想的孔洞結(jié)構(gòu)的支架時(shí)受到了明顯的挑戰(zhàn)，因此就限制了其在組織工程中的應(yīng)用。

表1 、聚合物納米纖維支架制備方法的比較Comparison of methods for fabricating polymer nanofiber scaffolds

1.2 分子自組裝

納米纖維基體還可以通過分子自組裝的方法來制備，主要包括單個(gè)分子自組裝形成固定的組織和利用非共價(jià)鍵作用(包括氫鍵、離子鍵、疏水作用等)穩(wěn)固層次結(jié)構(gòu)兩個(gè)過程[17,18]。核酸和蛋白質(zhì)合成及自組裝等自然過程，一般都包含細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一些特殊生物成分及模仿ECM的自組裝過程。

自組裝分子的一些特定基團(tuán)也需要被組裝進(jìn)納米纖維。例如：自組裝肽兩親分子(PAs)有一些關(guān)鍵性的結(jié)構(gòu)特征：長的烷基鏈?zhǔn)怯脕韨鬟f疏水作用這個(gè)自組裝驅(qū)動(dòng)力的；殘留的四個(gè)連續(xù)半胱氨酸是用來創(chuàng)造形成聚合物結(jié)構(gòu)的二硫鍵的；三個(gè)殘留甘氨酸的連接區(qū)域?yàn)橛H水基團(tuán)提供了靈活性；殘留的磷酸化絲氨酸在礦化過程加強(qiáng)了同鈣離子的相互作用；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽系列 (RGD)會(huì)增加細(xì)胞的黏附[19]。PAs在酸性條件下會(huì)自組裝形成直徑為5-8 nm，長度為1μm的納米纖維。這過程包含著用二硫蘇糖醇調(diào)控PA溶液的pH從8降到4。當(dāng)溶液酸化后，PAs就迅速變成不溶解的狀態(tài)，并形成納米纖維凝膠。除了pH的影響外，PAs的自組裝也可以通過干燥和引入二價(jià)離子(比如Ca2+)來獲得[20]。E.Beniash等報(bào)道自組裝水凝膠可以利用多價(jià)金屬離子作為媒介來誘捕細(xì)胞，并且該支架能夠支持成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)生存三個(gè)星期[21]。

Zhang等合成了離子自給的寡生肽，其結(jié)構(gòu)是由親水氨基酸和疏水氨基酸交替重復(fù)的規(guī)整結(jié)構(gòu)。在水里，寡勝肽就形成β態(tài)，并且呈現(xiàn)出極性表面(帶電離子鏈)和非極性面(丙氨酸)。當(dāng)暴露在一價(jià)堿性陽離子或者是生理環(huán)境的條件下，寡勝肽就迅速自組裝成為各種形態(tài)的水凝膠[89]。這些水凝膠是由互相交織的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的，其纖維直徑為10-20 nm，纖維間的間隙大約50-200 nm；納米纖維基體能夠支持哺乳類細(xì)胞的黏附、增殖和分化[23]。

除PAs和寡勝肽外，合成二嵌段/三嵌段共聚物[24]和樹枝狀聚合物[25]都可以自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)。然而作為再生生物材料，自組裝納米纖維支架在當(dāng)前卻受限于生物學(xué)分子，比如水凝膠的肽[18]，不能形成力學(xué)穩(wěn)固的三維結(jié)構(gòu)的支架。肽納米纖維容易形成碎片，而且容易受到胞吞作用的影響[21]。另外，此類支架的降解還沒有被系統(tǒng)的報(bào)道過。肽主鏈結(jié)構(gòu)的降解是通過酶起作用的，因此就不能隨意控制他們在體內(nèi)的降解行為了。

1.3 相分離

相分離法是制備微孔膜或多孔支架的一種常用方法，在高溫下均相的聚合物溶液通過冷卻發(fā)生相分離，形成富聚合物和富溶劑的雙相，冷凍干燥脫出稀釋劑后，富溶劑相脫除，剩余空間形成孔隙，富聚合物相則凝固形成支架骨架[26]。圖2[27]是聚合物溶液的溫度-濃度相圖，當(dāng)聚合物體系落于雙節(jié)線和旋節(jié)線之間的亞穩(wěn)區(qū)時(shí)，體系通過成核-生長機(jī)理分相，制備的支架形成孤立的閉孔結(jié)構(gòu)；當(dāng)體系落于旋節(jié)線下的非穩(wěn)定區(qū)，通過旋節(jié)線機(jī)理分相，制備出的支架有著相互貫通的孔結(jié)構(gòu)。各種各樣的生物降解聚合物都可以通過相分離技術(shù)制備成三維多孔支架[28,29]，通過控制聚合物體系和相分離條件，各種形貌和孔結(jié)構(gòu)的支架都可以制備出來，而且都已經(jīng)應(yīng)用于組織再生的研究。

但是早期采用相分離制備的支架一般都是實(shí)壁結(jié)構(gòu)，在模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)上還存在著較大差距。為了制得模仿天然膠原的纖維狀結(jié)構(gòu)的支架，研究者采用改進(jìn)的熱致相分離技術(shù)來達(dá)到這一目的。Peter等人[2]在這一方面做了大量的研究，首次采用相分離法制備了PLLA納米纖維支架，其纖維直徑在50-500 nm范圍內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)：納米級纖維基質(zhì)可由聚合物溶液經(jīng)過熱致凝膠化、溶劑抽提和冷凍干燥等過程制備。在冷凍干燥前，聚合物濃度、熱退火、溶劑交換和冷凍溫度對納米級結(jié)構(gòu)均有影響。但所制備的纖維基體卻缺乏大孔結(jié)構(gòu)(100μm)，為了克服該缺點(diǎn)，Peter課題組就將粒子粒濾技術(shù)與相分離技術(shù)相結(jié)合，采用不同的的致孔劑(水溶性的糖或氯化鈉)進(jìn)行致孔，除掉致孔劑，就得到有著連通性良好的大孔結(jié)構(gòu)的納米纖維支架，通過控制糖或NaCl的外觀形貌、尺寸來調(diào)節(jié)支架的大孔結(jié)構(gòu)[30]。為了模擬I型膠原的納米纖維基質(zhì)結(jié)構(gòu)，Chen VJ[31]等人利用相分離聯(lián)合粒子粒濾法制備了具有高度連通的球形中孔和納米纖維狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的支架。其方法是先制備石蠟微球，然后熱致聯(lián)結(jié)使其形成相互連接的模型，然后澆鑄PLLA溶液，用熱致相分離的原理促使形成納米纖維狀基質(zhì)；再濾出石蠟微球就合成了帶有相互連通球形孔的納米纖維狀的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這種相互連通的中孔結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)細(xì)胞在整個(gè)支架空隙中的傳播，有利于后期的分化、增殖，即合成出了類似天然細(xì)胞外基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的支架。Yang F等[32]采用液液相分離的方法，制備了高度多孔和纖維直徑在納米級的PLLA支架，隨后在此支架上進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)顯示神經(jīng)干細(xì)胞能夠識(shí)別納米結(jié)構(gòu)的支架，并且有利于神經(jīng)突的生長。

為了使支架更適用于臨床，Peter課題組結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助，將熱致相分離技術(shù)與固體自由成型技術(shù)(solid freeform fabficmion，SFF)相結(jié)合，制備出具有大孔或微孔的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的PLLA納米纖維支架，通過組織切片與計(jì)算機(jī)斷層掃描攝影，明確所要構(gòu)建的支架的精細(xì)結(jié)構(gòu)，再利用控制熱致相分離方法的各種參數(shù)，精確制備具有納米纖維結(jié)構(gòu)的支架[33]；或者是通過三維立體打印機(jī)得到所需要構(gòu)建的支架影像，再通過控制相分離技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件來制備合適的支架[34]，為快速地修復(fù)組織損傷創(chuàng)造了可能性。

但是現(xiàn)有采用相分離方法制備納米纖維支架的材料卻僅僅局限于聚乳酸等少數(shù)結(jié)晶性合成聚合物[2,35]，而有研究表明聚乳酸或是聚乙醇酸制備的納米纖維支架的降解實(shí)驗(yàn)在一個(gè)星期中就表現(xiàn)為支架大范圍的收縮，這將限制其在組織工程中的應(yīng)用，而由靜電紡絲制備得到的聚己內(nèi)酯納米纖維支架卻能夠在降解實(shí)驗(yàn)中維持良好的形態(tài)，為細(xì)胞繁殖和分化提供一個(gè)良好的載體[36]。因此，開發(fā)新的合成聚合物作為相分離法制備納米纖維支架的材料將是一個(gè)很有意義的工作。

1.4 細(xì)菌纖維素

細(xì)菌產(chǎn)生納米纖維的纖維素早就應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，包括生物學(xué)應(yīng)用等[37]。醋酸桿菌合成纖維素包括細(xì)胞外基質(zhì)葡糖聚合成鏈，然后鏈自組裝和結(jié)晶化形成不同級別的帶。細(xì)菌纖維素形成的納米纖維支架很容易生成100 nm以下的纖維直徑，而且不同的菌株會(huì)生成不同特點(diǎn)的纖維[38]，還可以通過在細(xì)菌生產(chǎn)纖維素的生長介質(zhì)中加入聚合物形成共聚物納米纖維支架[39]。圖3所示為醋酸桿菌沉積纖維素納米纖維的過程。

1.5 模板法

聚合物納米纖維還可采用模板法來制備，例如以自我有序多孔氧化鋁為模板。首先要制備孔徑大約為25-400 nm，孔深為100 nm-100μm的鋁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的模板。聚合物納米纖維陣列可以通過破壞模板或者機(jī)械分離模板得到，如圖4所示[40]。鋁模板制備的PCL納米纖維支架的纖維長度可以通過熔融時(shí)間和溫度等參數(shù)來控制[41]。

1.6 提拉法

納米纖維可以直接通過機(jī)械拉伸黏性聚合物流體得到[42]。如圖5所示，納米纖維可以直接拉伸得到：把一根放置在聚合物流體上，然后向上提拉形成一根單絲，冷卻后就形成了納米纖維。Xing X等用該方法制備了纖維直徑在60 nm以下，長達(dá)500 nm的聚三甲烯對苯二酸酯的納米纖維支架[43]。有一種自動(dòng)拉伸技術(shù)是利用移液管間歇滴涂聚合物流體溶液到基底上，然后使基底沿著x-y的方向交叉來回移動(dòng)，這個(gè)過程會(huì)使連接納米纖維的管接頭處形成圓狀微粒[44]。這種方法已用來制備高度有序的聚苯乙烯納米纖維支架，其直徑大小變化從幾納米到幾微米。

1.7 提取法

納米纖維還可以用化學(xué)和機(jī)械處理的方法從天然材料中提取。例如植物纖維素就可以從破碎的植物細(xì)胞壁中得到。例如有研究者就從麥稈和大豆中提取了直徑為10-120 nm，長度為幾千納米的纖維素納米纖維[45]。無脊椎動(dòng)物也是納米纖維提取的一個(gè)來源。從烏賊提取的甲殼素納米纖維直徑為3-4 nm，長度有幾微米[46]；從海生硅藻提取的聚乙酰葡萄糖胺納米纖維證明對紅血球具有高凝作用[47]。

1.8 氣相聚合

聚合物納米纖維也可以通過氣相聚合制備得到。等離子誘導(dǎo)乙烯基三氯硅烷氣相聚合形成的硅氧烷纖維直徑大約25 nm，長度約400-600 nm；氰基丙烯酸酯氣相聚合形成的納米纖維直徑約100-400 nm，長度達(dá)幾百微米[48,49]。

2 結(jié)論

組織修復(fù)工程中，納米纖維支架由于具有高的比表面及類似于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，而被證明更有利于細(xì)胞的粘附，繁殖及分化。靜電紡絲法、分子自組裝、熱致相分離法都是較常用的制備納米纖維支架的方法。其中，熱致相分離法由于設(shè)備簡單，耗用低、可以通過控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)制備出三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多孔納米纖維支架，表現(xiàn)出很大的潛力，但是熱致凝膠化的相分離方法的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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