竹葉黃酮和竹葉多糖清除亞硝酸鹽的作用

（武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程系——福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山354300）

竹葉在我國有著悠久的食用和藥用歷史，其性淡、微澀、寒、味甘，具有清熱利尿、明目解毒、止血、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗艾滋病和抑制腫瘤等功效，且無毒無害，可作為綠色食品進(jìn)行開發(fā)。竹葉黃酮和多糖在竹葉中的含量豐富，具有多種藥理和保健作用[1-4]。目前對竹葉的研究主要集中在竹葉提取物、竹葉黃酮、竹葉多糖抗氧化、清除自由基方面，而對于竹葉黃酮和多糖清除亞硝酸鹽的作用報(bào)道很少。閩北是中國竹子之鄉(xiāng)，但目前對竹葉的利用十分有限，大部分被廢棄物處理，未能得到充分的利用。本試驗(yàn)從竹葉中提取黃酮和多糖，測定了它們清除亞硝酸鹽的作用，并同Vc進(jìn)行比較，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器：MAPADA分光光度計(jì)、索氏脂肪提取器、旋轉(zhuǎn)攪拌儀、超聲洗滌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、湘儀H-2050R高速離心機(jī)等。

1.2 試劑：石油醚（沸程 30～60℃）、無水乙醇、鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉、蘆丁、硝酸鋁，葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸試劑、亞硝酸鈉、氯化銨、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、以上試劑均為AR，試驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

取25 mL刻度試管支，按下表加試劑：

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.2mg/mL）(mL) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 5%亞硝酸鈉(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%硝酸鋁(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4%氫氧化鈉(mL) 10.0 10.0 10.010.0 10.0 10.0 10.0

蒸餾水加至25mL搖勻，放置6分鐘，以1cm比色皿、1號管調(diào)零、500nm測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取25刻度試管7支，按下表加液：

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0重蒸水（mL） 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.0 0 3,5-二硝基水楊酸試劑（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混勻，在沸水中加熱5分鐘，取出，立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加重蒸水20mL混勻，用1號管調(diào)零，520nm測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：在25ml具塞比色管按下表加液：

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（10.0μg/mL）（mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5相當(dāng)于亞硝酸鈉（μg） 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0氯化銨緩沖液（mL） 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 60% 乙酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.4%對氨基苯磺酸(mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0混勻，靜置 3～5min 0.1%鹽酸萘乙二胺（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

重蒸水加至25mL，混勻，靜置5min，用1cm比色杯、1號管調(diào)零，538nm測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 竹葉黃酮和多糖的提?。褐袢~采自武夷學(xué)院內(nèi)，先用蒸餾水洗滌、80℃烘干、粉碎、過40目篩。將竹葉粉末置于索氏脂肪提取器，用石油醚回流去除脂肪、色素后用 80%乙醇為溶劑、固液比 1∶10、60℃攪拌45min，再以30℃超聲輔助5min的條件提取黃酮，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適量后以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)測定黃酮含量，直接用于實(shí)驗(yàn)。將提取黃酮后的竹葉殘?jiān)娓?，?0倍體積的蒸餾水、80℃、攪拌45min，再以30℃、250W超聲輔助5min的條件提取多糖，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至適量后以10%的三氯乙酸調(diào)pH至3.0沉淀蛋白質(zhì)，離心除蛋白后的多糖濃縮液80℃左右烘干水份得竹葉多糖粗品。精確稱取烘干的竹葉多糖粗品100mg，用蒸餾水溶解定容至100mL，過濾后用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖、總糖，計(jì)算多糖的含量和純度。

1.7 清除亞硝酸鹽的測定方法：在標(biāo)準(zhǔn)管中加入20μg的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液；在樣品空白管和樣品測定管中分別加入0.10～5.00（mL）1mg/mL濃度的竹葉黃酮、竹葉多糖、Vc，樣品測定各平行3管，各管再加入20μg的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液，混勻，靜置反應(yīng)5min后同標(biāo)準(zhǔn)曲線測定加入其余試劑后比色。樣品對亞硝酸鹽的清除率 （%）=[標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－（樣品測定管吸光度－樣品空白管吸光度）]÷標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度×100

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理：標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)；測定結(jié)果列出n，X±S，組間差異以t檢驗(yàn)或方差分析，SSR法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 竹葉黃酮的提取率為0.83%，竹葉多糖的提取率為1.15%，竹葉多糖的純度為83.3%。

2.2 蘆丁、葡萄糖、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果見表1。

表1 .蘆丁、葡萄糖、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果

2.3 不同劑量Vc、竹葉黃酮和竹葉多糖清除亞硝酸鹽的結(jié)果見表2、圖1。

表2 .不同劑量Vc、竹葉黃酮和竹葉多糖對亞硝酸鹽的清除率（%，n，X±S）

3 分析與討論

3.1 由表2和圖1測定結(jié)果見，竹葉黃酮對亞硝酸鹽有較強(qiáng)的清除率，劑量從0.1mg增加到4.0mg，清除率從15.72%增加到84.59%，劑量和作用之間基本呈線性關(guān)系（r=0.9649）；劑量再增加到5.0 mg，清除率不再顯著增加（P＞0.5）。竹葉多糖對亞硝酸鹽也有一定的清除率，劑量從0.1mg增加到3.0mg，清除率從8.55%增加到36.10%，劑量和作用之間也呈線性關(guān)系 （r=0.9789）；劑量再增加到4.0mg和5.0mg，清除率并不繼續(xù)增加（P＞0.4）。

3.2 Vc在體外對亞硝酸鹽的清除率相當(dāng)高，0.1mg劑量的清除率即達(dá)到61.24%，劑量增加到1.0mL時(shí)清除率已達(dá)到100%，故實(shí)驗(yàn)中Vc劑量不需再增加；清除率隨劑量增加的曲線似拋物線形，（r=0.8678）；而且Vc對亞硝酸鹽的清除率均顯著高于同劑量的桂花黃酮和多糖（均 P＜0.01或 0.001）。

3.3 N-亞硝基化合物是一種致癌性很強(qiáng)的化合物，至今已經(jīng)研究的近300種N-亞硝基化合物中，約90%以上具有致癌性，并證明N-亞硝基化合物可在體內(nèi)外由其前體物胺類與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成。正常情況下,人們直接從食物中攝入的亞硝胺和亞硝酰胺極少,但形成它們的前體物亞硝酸鹽卻大量存在于食物中,特別是亞硝酸鹽在人和動物的胃中更適宜合成亞硝胺。因此，清除體內(nèi)亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成是預(yù)防癌癥的有效途徑[5、6]。

許多學(xué)者研究了從天然植物中提取的黃酮類物質(zhì)對亞硝化反應(yīng)的抑制作用，認(rèn)為阻斷原理是：在模擬人體胃液的條件下，二甲胺與亞硝酸鈉在37℃條件下，可適宜地生成二甲基亞硝胺，當(dāng)往黃酮提取液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時(shí)，黃酮類物質(zhì)優(yōu)先同亞硝酸鈉作用，使二甲胺不能與亞硝酸鈉反應(yīng)，達(dá)到阻止亞硝胺生成的目的[7]。

3.4 一些資料報(bào)道了竹葉黃酮清除亞硝酸鹽的作用；據(jù)許剛等報(bào)道，竹葉的甲醇、乙醇、丙酮提取物濃度在0～146.3mg/mL時(shí)，對N-亞硝胺合成的阻斷率在0～92.86%；濃度0～97.54mg/mL時(shí)，對亞硝酸鹽的清除率在 0～90.07% （此時(shí)清除亞硝酸鹽約 100μg）[8]。據(jù)樓鼎鼎等報(bào)道，肉制品中添加竹葉抗氧化物(AOB，其中總黃酮含量32.3%），可減少產(chǎn)品中亞硝酸鹽的殘留量，當(dāng)AOB的添加量（以總黃酮計(jì)）為0.003%時(shí)，亞硝酸鹽含量比對照降低16%；當(dāng)AOB添加量0.01%時(shí),則降低20%以上；說明AOB具有一定的清除亞硝酸鹽的能力[9]。據(jù)吳洪報(bào)道，竹葉黃酮濃度從2.309增加到115.45（mg/mL），對亞硝酸鹽的清除率從9.84%增加到89.32%[10]。吳洪等還從18種中藥中提取黃酮，測定對亞硝酸鹽的清除率，作用較好的是化橘紅、橘皮、竹葉，黃芩、金錢草、甘草、桑白皮、桑椹黃酮類，對亞硝酸鹽的清除率最大分別可達(dá)到93.16%、89.49%、89.32% 、80.82% 。77.37% 、75.07% 、69.71% 、67.85%[11]，竹葉黃酮的最大清除率與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.5 許多植物多糖具有清除亞硝酸鹽的作用，據(jù)李碧嬋等報(bào)道，紅菇多糖劑量從0.125mg/mL增至0.375mg/mL，對亞硝酸鹽的清除率從15.72%顯著增加到45.3%，再增加多糖劑量時(shí)清除率反而下降[12]。據(jù)馮翠萍等報(bào)道，靈芝孢子粉多糖從1.2增加到2.5（mg/mL）對亞硝酸鹽的清除率從82.4%增加到88.3%[13]。據(jù)郭豫梅報(bào)道，0.164mg/mL的石參多糖對亞硝酸鹽的清除率為37.56%[14]。據(jù)李利華等報(bào)道，120.5mg的魚腥草多糖對15μg亞硝酸鹽的清除率達(dá)到64.37%[15]。據(jù)但飛君等報(bào)道，紅毛七多糖對多糖濃度為4.0mg/mL時(shí),對的清除率達(dá)85.1%[16]。據(jù)王曉梅等報(bào)道，朱砂七多糖濃度為5mg/ml時(shí),對亞硝胺合成的阻斷率為41.27%；濃度為0.09mg/ml時(shí)，對亞硝酸鹽的清除率最高，為67.03%[17]。據(jù)郭小鵬等報(bào)道，向25mL模擬胃液中加入50mg黃參多糖，反應(yīng)15min，對亞硝酸鹽清除率可達(dá)86.6%[18]。據(jù)李志英等報(bào)道，加入β-環(huán)糊精能使黃芪多糖對亞硝酸鹽的清除能力從29.1%提高到50.2%[19]。據(jù)張庭廷等報(bào)道，0.25mg 和 0.5mg 的枸杞多糖、金櫻子多糖、茶多糖對20μg亞硝酸鹽的清除率分別為 53.36% 和 99.72% 、48.29% 和 88.97% 、50.27% 和91.45%[20]。關(guān)于竹葉多糖清除亞硝酸鹽，目前尚未見報(bào)道，本文首次報(bào)道竹葉多糖清除亞硝酸鹽的作用，但清除率顯著小于竹葉黃酮和 Vc（均 P＜0.01或0.001），也小于大部分植物多糖對亞硝酸鹽的清除率。

[1] 陸志科，謝碧霞.竹葉化學(xué)成分的分析與資源的開發(fā)利用[J].林業(yè)科技開發(fā),2003(01).

[2] 吳三林，李書華，弓加文.竹葉活性成分的研究進(jìn)展[J].樂山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2005(05).

[3] 李飛躍，喻國光，陳金珠，等.竹葉主要化學(xué)成分分析及其生物活性研究現(xiàn)狀[J].江西林業(yè)科技，2006(42).

[4] 姚曦，岳永德，湯鋒，等.竹葉活性成分的研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2009(06).

[5] 周才瓊，周張章，范勇，等.不同茶樣沖泡浸出液對NO－2清除作用的體外試驗(yàn)研究[J].茶葉科學(xué)，2004，24(3)：201－206.

[6] 趙甲元，賈冬英，姚開，等.亞硝胺體內(nèi)外合成阻斷作用的研究[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46(1)：35－38.

[7] 張慶樂，吳守林，張麗青，等.植物黃酮在抑制亞硝化反應(yīng)中的應(yīng)用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28（6）：733－734.

[8] 許剛,張虹,龐潔.竹葉提取物對亞硝化反應(yīng)抑制作用的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22(1)：69－72.

[9] 樓鼎鼎，戚炯炯，張英，等.竹葉抗氧化物在雙匯西式肉制品中的應(yīng)用研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2006，6（3）：111－114.

[10] 吳洪.竹葉、竹茹對亞硝酸鹽的清除能力與總黃酮含量的相關(guān)性[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào).2010，32（8）：48－49.

[11] 吳洪，高平章.18種中藥材對亞硝酸鹽清除活性與黃酮含量相關(guān)性研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,39 （24）：14636－14638.

[12] 李碧嬋，李淼，王賀祥.紅菇子實(shí)體多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].中國食用菌，2012，3（1）：42～45.

[13] 馮翠萍，王曉聞，程旭東，等.靈芝孢子粉多糖的提取及其生物活性研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2009，9（3）：58－61.

[14]郭豫梅.野生石參中多糖含量的測定及抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（6）：93－95.

[15] 李利華.魚腥草多糖體外抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（6）：3286－3288.

[16] 但飛君,禇立軍，蔡正軍，等.紅毛七多糖體外抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(5)：398－400.

[17]王曉梅，李宗孝，任莉君.朱砂七多糖的抗氧化作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(34)：19346－19347.

[18] 郭小鵬，田呈瑞，高春燕，等.黃參粗多糖脫蛋白工藝以及對亞硝酸鹽清除作用的研究 [J].食品工業(yè)科技，2011，32（2）:274－276.

[19] 李志英，程麗麗.β－環(huán)糊精介質(zhì)中提取的黃芪多糖對亞硝酸根的清除作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（2）：70－72.

[20] 張庭廷，聶劉旺，陶瑞松，等.三種植物多糖抗氧化活性研究[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，25（1）：56－58.