電針聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬區(qū)CXCL2及受體CXCR2表達(dá)的影響*

李文媛，王 瑩，賈 樺，馮克儉，劉躍光

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，寧夏銀川 750004)

電針聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬區(qū)CXCL2及受體CXCR2表達(dá)的影響*

李文媛1，王 瑩1，賈 樺2，馮克儉1，劉躍光1

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，寧夏銀川 750004)

目的：探討電針聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)移植對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷后海馬區(qū)CXC趨化因子2(CXC chemokine ligand 2，CXCL2)及受體(CXC chemokine receptor 2，CXCR2)表達(dá)的影響。方法：采用線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組、ADSC移植組和電針+ADSC組5組。應(yīng)用NSS法行神經(jīng)功能損害評(píng)分，采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)海馬區(qū)CXCL2和CXCR2蛋白及其mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：電針+ADSC組海馬區(qū)PKH-26標(biāo)記的細(xì)胞個(gè)數(shù)高于ADSC組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。電針+ADSC組NSS評(píng)分低于單獨(dú)治療組(P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，電針+ADSC組和電針組的CXCL2和CXCR2蛋白和mRNA表達(dá)水平均下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：電針聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞移植促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)作用優(yōu)于單獨(dú)治療組，其機(jī)制可能是電針通過(guò)下調(diào)炎癥遞質(zhì)CXCL2和CXCR2的表達(dá)抑制炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)移植的ADSC遷移和存活。

電針;脂肪源性干細(xì)胞/治療;缺血再灌注損傷;CXCL2;CXCR2

干細(xì)胞移植治療腦缺血性疾病是近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。我們前期研究［1］發(fā)現(xiàn)：將脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)經(jīng)尾靜脈注射治療大鼠腦缺血損傷，可減輕神經(jīng)功能的缺損;但由于腦缺血區(qū)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致移植干細(xì)胞向缺血區(qū)遷移能力及存活率較低，其神經(jīng)再生效果并不理想［2］。有研究［1］表明：腦缺血侵潤(rùn)的炎性細(xì)胞有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和樹突狀細(xì)胞等，CXC趨化因子2(CXC chemokine ligand 2，CXCL2)是炎癥趨化因子，其相應(yīng)的受體CXC趨化因子受體2(CXC chemokine receptor 2，CXCR2)主要表達(dá)于上述炎性細(xì)胞的表面［2］。當(dāng)CXCL2與其受體CXCR2結(jié)合后會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重腦缺血的損傷。近年來(lái)有研究［3］發(fā)現(xiàn)：電針可增強(qiáng)脊髓損傷中移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活的數(shù)量和遷移能力，兩者聯(lián)合治療能協(xié)同促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，但作用機(jī)制還不清楚。本研究將通過(guò)觀察電針聯(lián)合ADSC移植對(duì)腦缺血后炎癥遞質(zhì)CXCL2和受體CXCR2表達(dá)的影響，探討電針與干細(xì)胞聯(lián)合治療腦缺血損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性 SD大鼠48只，清潔級(jí)，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK(遼)20030013。

1.2 試劑與儀器

兔抗大鼠CXCL2抗體、兔抗大鼠CXCR2抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;抗β-actin抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;PKH-26試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TRIzol試劑、SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs，購(gòu)自 Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標(biāo)志物，購(gòu)自日本 Takara公司;CXCL2、CXCR2和β-actin引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。Stratagene 3005實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國(guó)Stratagene公司產(chǎn)品;Meta Morph/DP10/BX41圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;G－6805電針儀，上海華誼儀器制造廠產(chǎn)品。

1.3 ADSC培養(yǎng)與PKH26標(biāo)記

脂肪組織由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)整形外科提供，來(lái)自于25～35歲要求去除腹部多余脂肪的健康成人，供體無(wú)傳染病及內(nèi)分泌疾病，男女?dāng)?shù)量比例為2∶8。告知其脂肪抽吸物將用于科學(xué)研究并知情同意。脂肪源性干細(xì)胞參照Z(yǔ)uk等［4］的方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，并換液傳代，分離培養(yǎng)取第3～5代的ADSC，制成單細(xì)胞懸液后，參照Tohill［1］的方法進(jìn)行PKH-26標(biāo)記ADSC。

1.4 模型的建立與動(dòng)物分組

大鼠按體質(zhì)量分層，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組、ADSC組及電針+ADSC組5組。正常對(duì)照組2只，其余每組12只。參照Longa等［5］的線栓改良法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。正常對(duì)照組不予任何干預(yù)。模型對(duì)照組：?jiǎn)渭冊(cè)炷＃挥枞魏胃深A(yù)。電針組和電針+ADSC組于造模成功后即刻、60 min、120 min、180 min進(jìn)行電針干預(yù)，針刺大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴位(參照華興邦制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》)。采用疏密波，頻率120次/min，強(qiáng)度1 mA，以局部肌肉輕微抖動(dòng)為度，每次持續(xù)刺激30 min。ADSC組和電針+ADSC組于造模成功后180 min分別經(jīng)尾靜脈注射已制備好的PKH-26標(biāo)記的同種異體 ADSC 懸液(500 μL ，4 ×106個(gè)/100 μL)［1］，其余3組注射等體積的PBS。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)估

采用 Chen等［4］報(bào)道的神經(jīng)功能損害評(píng)分表(neurological severity scores，NSS)，從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射、平衡4方面進(jìn)行神經(jīng)功能損害評(píng)估，18分為最嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害，即評(píng)分越高神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。分別于缺血后1 d、3 d及7 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行NSS評(píng)分。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

取每組6只大鼠海馬組織加入裂解液提取總蛋白，采用 BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜;封閉緩沖液封閉后，加入一抗(anti-CXCL2 1∶100稀釋，anti-CXCR2 1∶100稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶2000稀釋)孵育2 h，TBS洗凈后經(jīng)顯色液顯示15 min，掃描后經(jīng)Image J圖像分析軟件對(duì)印跡區(qū)進(jìn)行灰度分析。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取各組6只大鼠海馬組織進(jìn)行RNA提取，采用Zacharek等［6］報(bào)道方法進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)及熒光定量分析。引物設(shè)計(jì)及合成按照已報(bào)道的序列設(shè)計(jì)并合成CXCR2、CXCL2以及內(nèi)參照β-actin的特異性引物。各引物的序列為：CXCL2，上游5’-CCCGAAGCTCCCATGGTTAAG-3’，下游 5’-CCCTGGAAACCAGCCATTCTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為163bp;CXCR2，上游 5’-CTCCTGCCTAAGTGCAGCC-3’，下游5’-TAATTATGGCAAGGGGTGAGG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為202bp;β-actin，上游 5’-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3’，下游 5’-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為265 bp。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將各樣品測(cè)得的Ct值換算成拷貝數(shù)，分析各檢測(cè)樣本中目的基因拷貝數(shù)相對(duì)于陽(yáng)性定量參考樣品的基因拷貝數(shù)，分析方法利用 2－△△Ct方法。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ADSC 的培養(yǎng)

于相差顯微鏡下觀察。接種后24 h細(xì)胞貼壁，呈成纖維細(xì)胞樣外觀。培養(yǎng)48 h后可見細(xì)胞已經(jīng)充分伸展呈長(zhǎng)梭形，72 h后開始聚集形成細(xì)胞集落，6 d形成較密集的細(xì)胞群落。

2.2 NSS 評(píng)分檢測(cè)

正常對(duì)照組缺血后1 d、3 d和7 d NSS評(píng)分均為0分。缺血后1 d和3 d，與模型對(duì)照組對(duì)比，電針組、ADSC組和電針+ADSC組NSS評(píng)分差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺血后7 d，與模型對(duì)照組對(duì)比，電針組、ADSC組和電針+ADSC組NSS評(píng)分降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中電針 +ADSC組NSS評(píng)分低于電針組和ADSC組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組NSS評(píng)分 分，±s

表1 各組NSS評(píng)分 分，±s

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05;與電針組對(duì)比，#P＜0.05;與 ADSC組的對(duì)比，ΔP＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù)1 d 3 d 7 d正常對(duì)照組2000模型對(duì)照組 12 9.69 ±0.75 15.43 ±1.37 15.56 ±1.05電針組 12 8.43 ±1.39 13.96 ±1.36 11.56 ±0.81*ADSC 組 12 8.35 ± 1.97 14.28 ±1.82 11.47 ±0.66*電針 +ADSC 組 12 8.95 ±1.57 13.42 ±0.81 8.62 ±1.61*#Δ

2.3 PKH-26 標(biāo)記觀察

冰凍切片免疫熒光追蹤PKH-26標(biāo)記的移植ADSC，模型對(duì)照組、電針組、ADSC組和電針+ADSC組PKH-26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞吸光度值為分別為 0，0，(44.72 ±10.74)和(70.92 ±5.73)。電針 +ADSC 組PKH-26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞吸光度值高于ADSC組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 各組蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果

與模型對(duì)照組和ADSC組對(duì)比，電針+ADSC組和電針組海馬區(qū)CXCL2和CXCR2蛋白相對(duì)表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，電針+ADSC組和電針組CXCL2和CXCR2蛋白相對(duì)表達(dá)對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 海馬區(qū)CXCL2和CXCR2蛋白相對(duì)表達(dá)±s

表2 海馬區(qū)CXCL2和CXCR2蛋白相對(duì)表達(dá)±s

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P ＜0.05;與 ADSC 組對(duì)比，Δ P ＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù)CXCL2 CXCR2模型對(duì)照組6 0.88 ±0.05 1.07 ±0.11電針組 6 0.61 ±0.10* 0.73 ±0.09*Δ ADSC 組 6 0.98 ±0.06 1.08 ±0.10電針 +ADSC組 6 0.62±0.09*Δ 0.77±0.05*Δ

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

與模型對(duì)照組對(duì)比，電針+ADSC組和電針組海馬區(qū)CXCL2和CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，電針+ADSC組和電針組CXCL2和CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。見表3。

表3 海馬區(qū)CXCL2和CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)±s

表3 海馬區(qū)CXCL2和CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)±s

組 別 動(dòng)物數(shù) CXCL2 mRNA(2－ΔΔCt) CXCR2 mRNA(2－ΔΔCt )模型對(duì)照組0.0126 ±0.0010 0.0136 ± 0.0014電針組 6 0.0044 ±0.0006* 0.0081 ±0.0013*ADSC 組 6 0.0129 ±0.0015 0.0143 ±0.0013電針 +ADSC 組 6 0.0047 ±0.0007* 0.0086 ±0.0011 6*

3 討論

電針是針刺療法中的一種，是電刺激和針刺效應(yīng)的結(jié)合，因其具有低風(fēng)險(xiǎn)、操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床治療缺血性腦血管疾病的常用針刺方法。許多研究證實(shí)：電針能有效促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，但其作用機(jī)制尚不明確［3］。本實(shí)驗(yàn)中選取督脈大椎穴和心包經(jīng)的內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行電針治療腦缺血大鼠模型。內(nèi)關(guān)為心包經(jīng)絡(luò)穴，心包為心的護(hù)衛(wèi)，心主血脈，可調(diào)理心氣，促進(jìn)氣血的運(yùn)行。針刺內(nèi)關(guān)穴可調(diào)節(jié)心、脈、血、神，達(dá)寧心調(diào)血安神之目的。大椎為督脈之要穴，是陽(yáng)氣的集中點(diǎn)，針刺大椎可振奮六陽(yáng)經(jīng)和督脈之陽(yáng)氣，使氣血流暢，上行于腦，而發(fā)揮活血化瘀，健腦補(bǔ)髓，醒腦開竅的作用［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：電針組NSS評(píng)分低于模型對(duì)照組，證實(shí)大椎穴和內(nèi)關(guān)穴行電針治療能夠促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)。

缺血后腦組織內(nèi)趨化因子CXCL2及其受體CXCR2的表達(dá)增加。CXCL2與其受體CXCR2結(jié)合后其表達(dá)活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等炎性細(xì)胞向缺血損傷區(qū)趨化游走并聚集，加重?fù)p傷區(qū)的炎癥反應(yīng)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)：電針組CXCL2和CXCR2蛋白和基因表達(dá)水平較模型對(duì)照組降低，而且電針+ADSC組海馬區(qū)PKH-26標(biāo)記ADSC陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)多于ADSC組。因此我們推測(cè)電針治療可通過(guò)下調(diào)海馬區(qū)CXCL2和CXCR2的表達(dá)，抑制腦缺血損傷的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了移植的ADSC在腦缺血區(qū)的存活和遷移。

近年來(lái)，ADSC由于其來(lái)源廣、易于體外擴(kuò)增純化，已成為干細(xì)胞治療腦缺血損傷研究的熱點(diǎn)［1］。有研究者［3］發(fā)現(xiàn)：電針可增強(qiáng)脊髓損傷中移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活的數(shù)量和遷移能力，聯(lián)合電針和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠協(xié)同促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生。李曉濱等［9］也證實(shí)督脈電針與神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合能夠顯著促進(jìn)全離斷脊髓的功能修復(fù)。但聯(lián)合治療是否同樣協(xié)同促進(jìn)腦缺血損傷神經(jīng)再生則未見相關(guān)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合電針和ADSC移植治療腦缺血大鼠模型。研究結(jié)果表明：與模型對(duì)照組對(duì)比，雖然電針組和ADSC組均能降低NSS評(píng)分，但電針聯(lián)合ADSC治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)治療組。聯(lián)合治療的協(xié)同作用機(jī)制可能是：一方面電針可通過(guò)抑制與CXCR2和CXCL2的有關(guān)的炎性反應(yīng)，促進(jìn)移植的ADSC在腦缺血區(qū)的存活和遷移;另一方面，增多的ADSC通過(guò)分化為神經(jīng)元細(xì)胞和分泌上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)再生。

綜上所述，本研究證實(shí)了聯(lián)合應(yīng)用電針和ADSC移植治療從功能上能夠促進(jìn)腦缺血神經(jīng)再生，其機(jī)制可能與電針下調(diào)海馬區(qū)炎癥遞質(zhì)CXCL2和CXCR2的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)移植的ADSC遷移和存活有關(guān)。

［1］王瑩，李文媛，李明秋，等.黃芪皂甙Ⅳ聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31(20)：3963 －3966.

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R245.9+7

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.031

1001－6910(2012)09－0061－04

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王瑩，博士，講師，E-mail：yingwang770224@163.com

黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)1152G050);黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(編號(hào)2010243)

2011－11－13;

2012－02－22

(編輯 陶 珠)

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