MIF對(duì)子癇前期氧化應(yīng)激機(jī)制的影響*

謝曉芳 張 靜 詹 瑛 葉元華

(1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校婦產(chǎn)科，山東 菏澤 274000； 2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校婦產(chǎn)科，河北 滄州 061001；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東 青島 266003)

子癇前期(preeclampsia，PE) 是人類妊娠期特有的原因不明的多系統(tǒng)疾病，也是導(dǎo)致孕婦及圍生兒病死率和死亡率的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制始終是產(chǎn)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，子癇前期存在明顯的氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)，氧化應(yīng)激水平增高可能是子癇前期的重要發(fā)病因素之一[1]。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibition factor，MIF)是在活化的T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，具有多種生物活性，是缺氧及其信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子之一[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，MIF在胎盤組織中有表達(dá)，并參與全部妊娠過程，在維護(hù)母胎間的免疫赦免機(jī)制中起重要作用。為此，本研究通過檢測(cè)MIF在子癇前期及正常晚期孕婦胎盤組織中的表達(dá)，同期檢測(cè)子癇前期及正常晚期孕婦胎盤組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)等氧化應(yīng)激指標(biāo)，初步探討MIF與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年3～10月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦71例，其中子癇前期孕婦38例(子癇前期組)，平均年齡(28±4)歲，平均孕周(36±3)周。同期行剖宮產(chǎn)的正常晚期孕婦(對(duì)照組)33例，平均年齡(29±3)歲，平均孕周(37±4)周。兩組孕婦年齡及孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)[4]。兩組孕婦均無慢性高血壓、糖尿病、感染、腎炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等病史，無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。此次妊娠也無胎膜早破及感染征象。

1.2 研究方法

1.2.1標(biāo)本采集 各組孕婦胎盤娩出后30 min內(nèi)，在無菌狀態(tài)下于胎盤母體面中央(避開壞死及鈣化區(qū))取一塊胎盤組織約1 cm×1 cm×1 cm，生理鹽水漂洗至洗液清澈，放置于-70℃冰箱保存，用于提取RNA。

1.2.2RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胎盤組織中MIF mRNA的表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，總RNA提取試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，MIF引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。MIF上游引物：5′-GCCCGGACAGGGTCTACA-3′，下游引物：5′-CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT-3′，目的片段為125 bp；內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氧酶(GAPDH)正向引物：5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGG-3′，反向引物：5′-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為102 bp。cDNA的合成按試劑盒操作步驟，MIF擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，然后按94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5 μl反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)果用計(jì)算機(jī)掃描分析，以各檢測(cè)標(biāo)本中MIF與GAPDH擴(kuò)增條帶的實(shí)際灰度值的比值表示MIF mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo) 組織裂解、離心后得組織勻漿。掃描及分析系統(tǒng)檢測(cè)各條帶相對(duì)吸光度值。采用南京建成生物工程所提供的SOD、MDA、H2O2試劑盒，測(cè)定胎盤組織勻漿液各指標(biāo)。以上操作均按試劑盒指導(dǎo)步驟完成操作，按公式計(jì)算相應(yīng)SOD活力及MDA、H2O2含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。子癇前期組孕婦與對(duì)照組孕婦一般資料比較及實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用t檢驗(yàn)，對(duì)胎盤組織中的H2O2含量與MIF mRNA表達(dá)水平進(jìn)行簡(jiǎn)單直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組胎盤組織中MIF mRNA的表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組孕婦胎盤組織中均有MIF mRNA的表達(dá)，子癇前期組孕婦胎盤組織中MIF mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組孕婦，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。見表1，圖1。

表1 兩組胎盤組織中MIF mRNA表達(dá)水平、SOD活力、MDA及H2O2含量比較

M：標(biāo)志物 1：對(duì)照組 2：子癇前期組 3～4：內(nèi)參照

2.2 兩組孕婦胎盤組織中SOD活力、MDA及H2O2含量比較

子癇前期組孕婦胎盤組織中SOD活力較對(duì)照組孕婦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。子癇前期組孕婦胎盤組織中MDA含量較對(duì)照組孕婦顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。H2O2含量在子癇前期組孕婦胎盤組織中也顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。見表1。

2.3 MIF mRNA與H2O2含量相關(guān)性分析

對(duì)照組孕婦胎盤組織中MIF mRNA表達(dá)水平與H2O2含量呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.65，P﹤0.01)；子癇前期組孕婦胎盤組織中MIF mRNA表達(dá)水平與H2O2含量也呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.74，P﹤0.01)。

3 討 論

3.1 MIF在子癇前期孕婦胎盤組織中表達(dá)的變化及意義

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，進(jìn)而激活或損傷內(nèi)皮細(xì)胞。MIF是含有115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量12.5 kD，具有由α鏈和β鏈組成的三維結(jié)構(gòu)。目前認(rèn)為，MIF分子不屬于目前已發(fā)現(xiàn)的任何細(xì)胞因子家族，是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，具有多種生物活性。MIF廣泛表達(dá)于多種系統(tǒng)、組織的細(xì)胞中，參與機(jī)體多種生理、生化過程，在炎癥、免疫、細(xì)胞凋亡和增殖中起中心樞紐作用。有研究表明，MIF與冠心病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其與子癇前期發(fā)病關(guān)系的研究報(bào)道較少。目前雖已有研究證實(shí)，子癇前期患者血漿中MIF水平較正常妊娠婦女明顯增高，但引起增高的原因尚未明了。本研究結(jié)果顯示，子癇前期組孕婦胎盤組織中MIF水平均明顯高于正常孕婦，提示胎盤組織中的MIF 在子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，MIF在整個(gè)妊娠的絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層以及蛻膜組織中的滋養(yǎng)層細(xì)胞均可表達(dá)[5]。最近的體外研究顯示，氧氣可調(diào)節(jié)MIF在胎盤絨毛組織的表達(dá)，低氧條件下，MIF在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)明顯增多，表明MIF是缺氧及其信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子之一[2]。與正常孕婦相比，子癇前期患者因遺傳及免疫因素造成子宮胎盤血管重構(gòu)障礙，滋養(yǎng)層侵入子宮肌層過淺，胎盤血流灌注減少，局部處于缺血缺氧狀態(tài)，釋放大量MIF進(jìn)入體循環(huán)，可進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和活化的 T細(xì)胞分泌更大量細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6。TNF-α可激活線粒體電子傳遞回路輔酶Q中的超氧化物，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)顯著增強(qiáng)，而活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞在吞噬和免疫過程中都能產(chǎn)生大量氧自由基，激活氧化酶系統(tǒng)，而抗氧化能力未能相應(yīng)提高[5]。過多氧自由基超出機(jī)體清除能力，造成氧化應(yīng)激狀態(tài)，致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管痙攣，從而表現(xiàn)為子癇前期的各種臨床癥狀。

3.2 SOD、MDA及H2O2在子癇前期孕婦胎盤組織中表達(dá)的變化及意義

自Stark首次提出氧化應(yīng)激在子癇前期的病理生理發(fā)展中存在潛在作用以來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注氧化應(yīng)激與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。氧化應(yīng)激過程中生成的大量自由基、活性氧簇、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可參與疾病的發(fā)生發(fā)展。自由基可引起生物膜多價(jià)不飽和脂肪酸過氧化生成過氧化脂質(zhì)，其代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)可與磷脂類物質(zhì)DNA、RNA上堿基交聯(lián)，使蛋白質(zhì)變性，遺傳信息突變，導(dǎo)致細(xì)胞膜廣泛損傷[7]。超氧化物歧化酶(SOD)可催化氧自由基至H2O2的歧化轉(zhuǎn)換成O2和H2O2起抗氧化作用，并可阻斷MDA與核酸堿基的交聯(lián)，阻止蛋白質(zhì)變性失活[8]。二者均是常用的氧化應(yīng)激指標(biāo)。

研究顯示，子癇前期患者外周血中抗氧化酶SOD含量減少，MDA含量增高[9]。Vanderlelie等[10]對(duì)子癇前期患者與正常妊娠婦女胎盤組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，SOD、硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白等抗氧化酶及還原性谷胱甘肽等具還原性物質(zhì)在子癇前期胎盤組織中顯著減少；脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA、4-HNE等含量明顯增多，提示胎盤組織中抗氧化酶含量降低及氧化反應(yīng)增強(qiáng)，與子癇前期的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果也顯示，子癇前期孕婦胎盤組織中SOD活力較對(duì)照組孕婦明顯下降，MDA含量較正常妊娠組明顯增高，與目前文獻(xiàn)報(bào)道一致。SOD/MDA降低，表明子癇前期胎盤組織內(nèi)自由基產(chǎn)生過多，超過體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的代償能力。同時(shí)，胎盤組織抗氧化能力降低，加重了氧化與抗氧化失衡。脂質(zhì)過氧化過強(qiáng)，可改變細(xì)胞的流動(dòng)性、通透性和抗原性，使細(xì)胞喪失正常生理功能，從而造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起一系列臨床病理表現(xiàn)。

3.3 子癇前期孕婦胎盤組織中H2O2含量變化與MIF水平的相關(guān)性

本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MIF在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著高于對(duì)照組孕婦，同期檢測(cè)到H2O2高于對(duì)照組孕婦，且MIF與H2O2的量存在正相關(guān)，表明MIF的增加導(dǎo)致機(jī)體清除H2O2能力下降。H2O2是氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量增高進(jìn)一步證實(shí)子癇前期局部組織氧化反應(yīng)增強(qiáng)，且因H2O2作為信號(hào)分子的特殊身份，可能進(jìn)一步影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。本研究結(jié)果提示在子癇前期的發(fā)病過程中，MIF可能是通過調(diào)節(jié)H2O2的濃度在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

子癇前期胎盤組織中MIF表達(dá)量的顯著增加為子癇前期的發(fā)病機(jī)制氧化應(yīng)激學(xué)說提供了新的證據(jù)，深入研究MIF在子癇前期中的作用機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)將有助于子癇前期疾病的防治。

[1] 錢中清,曾耀英,朱斌,等.子癇前期患者系統(tǒng)性氧化應(yīng)激反應(yīng)的檢測(cè)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,30(4):343-347.

[2] 胡曉琳,潘平喜,楊麗,等.缺氧對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞游走抑制因子的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2009,40(2):260-262.

[3] Viganò P, Cintorino M, Schatz F, et al.The role of macrophage migration inhibitory factor in maintaining the immune privilege at the fetal-maternal interface[J]. Semin Immunopathol, 2007, 29:135-150.

[4] 樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009:92-99.

[5] Arcuri F, Buchwalder L, Toti P, et al.Differential regulation of colony stimulating factor 1 and macrophage migration inhibitory factor expression by inflammatory cytokines in term human decidua: implications for macrophage trafficking at the fetal-maternal interface[J]. Biol Reprod, 2007,76:433-439.

[6] Sankaralingam S，Arenas IA，Lalu MM，et a1．Preeclampsia:current understanding of the molecular basis of vascular dysfunction[J]．Expert Rev Mol Med,2006,8(3):1-20.

[7] Lykkesfeldt J.Malondialdehyde as biomarker of oxidative damage to lipids caused by smoking[J].Clin Chim Acta,2007,380:50-58.

[8] Johnson F,GiuIivi C．Superoxide dismutases and their impact upon human health[J].Mol Aspects Med,2005,26:340-352.

[9] Zhou JF，Wang XY，Shangguan XJ，et a1.Increased oxidative stress in women with pregnancy-induced hypertension[J].Biomed Environ Sci,2005,18:419-426.

[10] Vanderlelie J,Venardos K,Clifton VL,et a1.Increased biological oxidation and reduced anti-oxidant enzyme activity in pre-eclamptic placentae[J].Placenta,2005，26:53-58.