生物肽SP對NK細(xì)胞活化性受體NCRs表達(dá)的影響

傅煒昕，秦博，顧鵬毅，黃勤俊，梁再賦

(中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心一部暨國家中藥管理局中藥生物工程科研Ⅲ級實驗室，遼寧沈陽110001)

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對機(jī)體免疫功能具有重要的調(diào)控作用。生物肽P物質(zhì)(Substance P，SP)不僅是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，而且還是神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同的化學(xué)語言［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是SP的主要來源，而免疫細(xì)胞是SP的另一來源。外周神經(jīng)末梢釋放SP參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的SP則以自分泌或/和旁分泌的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，已有實驗證明SP可從多方面影響各種免疫細(xì)胞［2-3］。自然殺傷細(xì)胞(Naturalkillercells，NK細(xì)胞)是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞功能的發(fā)揮主要依賴于NK細(xì)胞能表達(dá)多種與主要組織相容性抗原(MHC)和非MHC類配體結(jié)合的受體，而傳遞的抑制或激活信號，NK細(xì)胞的活化取決于激活信號與抑制信號的平衡［4-5］。已發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞表面的活化性受體包括自然細(xì)胞毒受體(Natural cytotoxicity receptors，NCRs)、NKG2D、活化殺傷免疫球蛋白樣受體(Killer immunogloblin-1ike receptors，KIRs)及其他輔助刺激活化性受體2B4、DNAM-1、NTB-A、CD59等［4］。目前，關(guān)于SP對NK細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控及作用機(jī)制的研究，國內(nèi)外報道較少，且其作用機(jī)制尚未明確。本研究以非IL-2依賴的NK92-MI細(xì)胞株為對象，研究SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響，并測定SP對NK92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)的表達(dá)的影響，以闡明SP對NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料α-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，馬血清及胎牛血清(Hyclone)，SP(Sigma)。

1.1.2 試劑Trizol試劑(Invitrogen)，Real-Time PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa)，流式細(xì)胞抗體(APCNKp46單抗、PE-NKp30單抗、NKp44單抗，R＆D)。

1.1.3 主要儀器流式細(xì)胞儀(BD)，PCR儀(MJ Research Inc)，Real-Time PCR System(ABI PRISM)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響取對數(shù)生長期的NK92-MI細(xì)胞(4×105/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)用不同濃度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8、10－6mol/L)刺激24 h，作為效應(yīng)細(xì)胞;以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，效靶細(xì)胞共同孵育4 h(效靶細(xì)胞比為4∶1);加入MTT液(5 mg/mL)，再繼續(xù)孵育4 h;然后各孔吸棄上清液，加入DMSO和甘氨酸緩沖液，振蕩15～20 min;用酶標(biāo)儀于570 nm處測定OD值。按下列公式計算NK92-MI細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率:

NK細(xì)胞殺傷率(%)=(1－(殺傷實驗組OD值－效應(yīng)細(xì)胞對照組OD值)/靶細(xì)胞對照組OD值)×100%

1.2.2 Real-Time PCR檢測活化性受體NCRs的mRNA表達(dá)水平①引物設(shè)計:NKp44、NKp46、NKp30的引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由金思特科技有限公司(南京)合成，各引物序列見表1;②Real-Time PCR:取對數(shù)生長期的NK92-MI細(xì)胞(約1×107個)，用不同濃度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8mol/L)分別作用4、12和24 h，在各時間點收集細(xì)胞;用異硫氰酸胍(Trizol)法提取總RNA。RT反應(yīng)體系為10 μL(細(xì)胞總RNA 1.0 μL、5×Prime Script TM Buffer 4.0 μL、Prime Script TM Enzyme MixⅠ0.5 μL、Oligo dT引物0.5 μL、隨機(jī)引物6 0.5 μL、無RNA酶H2O 3.5 μL);反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃、15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃、5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活);PCR反應(yīng)體系為20 μL(模板cDNA 2.0 μL、SYBY Primix Ex TaqTM 10 μL、PCR上游引物0.4 μL、PCR下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、無菌H2O 6.8 μL);PCR反應(yīng)為2步法:①95℃，30 s(預(yù)變性);②95℃，5 s;60℃，34 s(40個循環(huán));應(yīng)用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行檢測，以18S rRNA作參照基因，用2－ΔΔCt法比較實驗組相對表達(dá)量與對照組的倍數(shù)差異，計算公式如下:

表1 Real-Time PCR用引物Table 1 Primer sequences used in real-Time PCR

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測NK92-MI細(xì)胞NKp44、NKp46和NKp30的膜表達(dá)取對數(shù)生長期的NK92-MI細(xì)胞(1×106/mL)，接種于6孔板，用10－14～10－8mol/L的SP作用24 h，收集細(xì)胞，用人IgG室溫封閉Fc受體(15 min);加入熒光標(biāo)記單抗(PE-NKp30單抗或APC-NKp46單抗或未標(biāo)記的NKp44單抗)，4℃避光孵育30～45 min;未標(biāo)記的NKp44抗體還需與FITC標(biāo)記的二抗再孵育30 min。細(xì)胞重懸于含0.5%BSA的PBS緩沖液中，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉχ±SD)表示，各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 13.3統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)作用

經(jīng)一定濃度(10－14～10－6mol/L)的SP作用24 h后，用MTT釋放法檢測NK92-MI細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果顯示較低濃度的SP對NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性均顯示有增強(qiáng)作用(10－14mol/L組:89.74%，10－12mol/L組:95.66%，10－10mol/L組:94.6%，10－8mol/L組:88.89%)，其中10－14～10－10mol/L組與對照組(78.31%)比較，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，10－8mol/L組具有顯著性差異(P＜0.05)。而高濃度10－6mol/L的SP對NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性則無明顯影響。

2.2 SP增加NK92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs的mRNA表達(dá)

選擇促殺傷活性作用較強(qiáng)的濃度(10－14～10－8mol/L)的SP刺激NK92-MI細(xì)胞4、12和24 h后，NCRs的mRNA表達(dá)水平用Real-Time PCR法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2和圖1。

表2 NK92-MI細(xì)胞NCRs mRNA的相對定量(ˉχ±SD)Table 2 Relative quantitation of NCRs mRNA in NK92-MI cells(ˉχ±SD)

圖1 NCRs的Real-time PCR擴(kuò)增曲線圖Fig.1 Real-time PCR amplification curve of NCRs

2.2.1 SP對NKp46 mRNA表達(dá)水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp46的mRNA表達(dá)已開始增加;較高濃度(10－10～10－8mol/L)SP作用12 h，NKp46的mRNA表達(dá)呈增加趨勢(P＜0.05);作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp46的mRNA水平，與對照組比較，差異性非常顯著(P＜0.01)。

2.2.2 SP對NKp44 mRNA表達(dá)水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp44的mRNA表達(dá)已增加(P＜0.05);較高濃度SP作用12 h，NKp44的mRNA表達(dá)亦呈增加趨勢，其中10－10～10－8mol/L組P＜0.01、10－12mol/L組P＜0.05;作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp44的mRNA水平，與對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)。

2.2.3 SP對NKp30 mRNA表達(dá)水平的影響高濃度(10－8mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表達(dá)已明顯增加(P＜0.01);較高濃度(10－10mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表達(dá)也有所增加(P＜0.05);作用24 h時，各濃度的SP均可明顯增加NKp30的mRNA水平，與對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)。

2.3 SP對NK92-MI細(xì)胞NKp46、NKp44及NKp30受體膜表達(dá)的影響

10－14～10－8mol/L的SP作用NK92-MI細(xì)胞24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測NKp46、NKp44及NKp30的膜表達(dá)水平，結(jié)果見表3和圖2。

表3 SP對NK92-MI細(xì)胞NCRs分子膜表達(dá)(%)的影響(ˉχ±SD)Table 3 Effects on surface expression of NCRs in NK92-MI cells by SP(ˉχ±SD)

各濃度的SP均可增加NKp46的膜表達(dá)，與對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);而NKp46膜表達(dá)水平的增高隨SP濃度的升高而回落，提示SP的調(diào)節(jié)作用可能具有雙向性。僅較低濃度(10－14mol/L)的SP對NKp44的膜表達(dá)有增加作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);同樣NKp44膜表達(dá)水平的趨勢隨SP濃度的升高而回落，高濃度(10－8mol/L)組甚至有所下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。各濃度的SP對NKp30的膜表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測NCRs膜表達(dá)Fig.2 FACS histograms of NCRs

3 討論

SP是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)反應(yīng)時分泌的一種生物活性多肽，廣泛分布于細(xì)的初級傳入神經(jīng)纖維內(nèi)。SP具有多種生理功能，且SP作為一種神經(jīng)炎癥因子，與臨床的多種疾病有關(guān)。在各種生理和病理條件下，SP能以神經(jīng)內(nèi)分泌的方式作用于各種免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)。已有一些研究證據(jù)表明SP對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，SP可刺激外周血NK細(xì)胞的遷移和細(xì)胞毒活性，并調(diào)節(jié)炎癥部位的NK細(xì)胞分泌IFN-γ，某些疾病狀態(tài)致外周血SP濃度升高而抑制NK細(xì)胞的殺傷活性。可見，SP在不同條件下所起的作用具有復(fù)雜性和多樣性［6-7］。

NK細(xì)胞參與免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展及效應(yīng)等重要環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)過程，是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，也是獲得性免疫的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞，NK細(xì)胞無需特異性抗原識別便可直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞。NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用主要歸功于非HLA限制性活化性受體的表達(dá)，這類受體主要包括NCRs和NKG2D等［4，8-9］。NCRs為近年發(fā)現(xiàn)的一類非MHC限制的特異性啟動NK細(xì)胞活化的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族受體，成員包括NKp46、NKp44和NKp30，其中NKp46和NKp30在所有靜止和活化的NK細(xì)胞都表達(dá)，是NK細(xì)胞組成性表達(dá)受體;NKp44僅表達(dá)于活化的NK細(xì)胞，是人類NK細(xì)胞活化的最佳標(biāo)志［10-12］。NCRs以非MHC依賴性方式直接殺傷靶細(xì)胞的活性使它們與其他活化性受體(如CD2和KIR2DS)區(qū)分開來。NCRs的配體至今還未明確，但推測白血病細(xì)胞表面表達(dá)NCRs的特異性配體。NCRs也可與病毒產(chǎn)物相互作用，NKp46和NKp44可識別流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素、神經(jīng)酰胺酶病毒蛋白，發(fā)揮NK細(xì)胞的抗病毒效應(yīng)［4，13-14］。NCRs的表達(dá)可受細(xì)胞因子、疾病狀態(tài)、藥物等的影響。NCRs在細(xì)胞表面的表達(dá)程度與NK細(xì)胞功能的發(fā)揮密切相關(guān)。目前有關(guān)SP對NK細(xì)胞功能性受體NCRs等表達(dá)的影響研究，尚少見報道。因此，對NCRs的表達(dá)情況以及SP對其表達(dá)的影響進(jìn)行研究，不僅能揭示NK細(xì)胞的活化程度及功能狀態(tài)，而且將在分子水平闡釋SP對NK細(xì)胞生物學(xué)活性的調(diào)控作用及內(nèi)在機(jī)制。

研究已證實生理濃度范圍的SP對NK細(xì)胞的殺傷活性有增強(qiáng)作用;且SP通過增加NK細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶)的表達(dá)來直接調(diào)節(jié)其殺傷活性。鑒于NCRs分子與NK細(xì)胞殺傷活性的密切聯(lián)系，進(jìn)一步研究SP對NK細(xì)胞NCRs表達(dá)的影響。結(jié)果顯示SP可同時增加3種活化性受體的轉(zhuǎn)錄水平，但對這些受體的膜表達(dá)的作用各不相同。推測SP可以作為一種活化因子，通過增加活化性受體NCRs的表達(dá)，來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。其中NKp46參與這種調(diào)控作用，而與NKp30和NKp44無明顯關(guān)系，這可能是同一細(xì)胞不同活化性受體競爭表達(dá)的結(jié)果。另外，SP對NKp46和NKp44膜表達(dá)水平的上調(diào)作用隨著SP濃度的升高反而回落，提示SP對NK細(xì)胞的功能可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了SP活化NK細(xì)胞、介導(dǎo)其免疫功能的效應(yīng)分子，將為探索提高NK細(xì)胞對腫瘤、病毒感染細(xì)胞的殺傷活性，用于細(xì)胞過繼免疫治療提供新的思路，也有助于深入理解神經(jīng)系統(tǒng)對NK細(xì)胞生物學(xué)活性及功能的調(diào)節(jié)作用。

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