衛(wèi)星靈芝液體發(fā)酵富集硒鋅的研究

楊澤濤，李莉，陳超，修翠娟

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng)122000)

靈芝素有“仙草”、“瑞草”之稱(chēng)，它因有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本、延年益壽等獨(dú)特功效而馳名中外?，F(xiàn)代科學(xué)分析表明，靈芝的營(yíng)養(yǎng)豐富且醫(yī)食價(jià)值高，它含有人體必須的氨基酸、脂肪酸、微量元素、胡蘿卜素及生物活性多糖等。藥食用真菌富含多糖，靈芝多糖具有多種生理功能，如抗衰老，防治癌癥等，能提高機(jī)體免疫力和耐氧能力，清除自由基，抑制腫瘤，抗輻射，提高肝臟、骨髓血液合成DNA、RNA和蛋白質(zhì)的能力［1-4］。硒、鋅是人體必需的微量元素，硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的組成成分，具有保護(hù)細(xì)胞膜和血紅蛋白免受氧化的作用。研究證實(shí)人類(lèi)的克山病、大骨節(jié)病、冠心病、糖尿病、癌癥等多種疾病都與缺硒有關(guān)。鋅是多種酶、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分，參與人體基因的復(fù)制、蛋白質(zhì)的生物合成、激素與受體的特異結(jié)合，能促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育與組織再生，提高動(dòng)物體的生理和代謝功能及免疫作用。人體缺乏鋅會(huì)食欲不振、生長(zhǎng)遲緩、免疫力下降、生殖機(jī)能受損等［5-9］。本文以靈芝為載體，采用深層發(fā)酵的方法生物富集硒、鋅，通過(guò)生物轉(zhuǎn)換作用將無(wú)機(jī)硒、鋅轉(zhuǎn)化為生物活性硒、鋅，提高靈芝的利用價(jià)值，為藥食用真菌富集微量元素的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種衛(wèi)星靈芝2號(hào)菌株，由遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種中心提供，是1996年經(jīng)我國(guó)“961020”返地式衛(wèi)星搭載后篩選出的太空誘變菌株。

1.1.2 原料玉米粉、黃豆粉、麩皮均為市售。

1.1.3 培養(yǎng)基①母種PDA綜合培養(yǎng)基(g/100 mL):去皮馬鈴薯20，葡萄糖2，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.15，酵母膏0.3，瓊脂2，維生素B11片/L，pH自然，蒸餾水配制;②液體種子培養(yǎng)基(g/100 mL):玉米面1.5，葡萄糖1，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，維生素B11片/L，pH自然，蒸餾水配制;③發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100 mL):玉米粉3，葡萄糖3，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，維生素B11片/L，pH 6.0，蒸餾水配制。

1.1.4 化學(xué)試劑葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、維生素B1、酵母膏、Na2SeO3、ZnSO4。

1.1.5 主要儀器回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜，醫(yī)用電熱恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，超凈工作臺(tái)，原子吸收分光光度計(jì)，AFS-830a雙道原子熒光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 分析方法①生物量測(cè)量方法:發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心15 min后收集菌絲體，用蒸餾水沖洗2～3次，70℃烘干至恒重，稱(chēng)重;②鋅、硒含量測(cè)定:采用火焰原子吸收分光光度計(jì)及AFS-830a雙道原子熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定;③鋅、硒富集率的計(jì)算方法:鋅、硒富集率(%)=(菌絲體產(chǎn)率(%)×(菌絲體中鋅、硒含量mg/kg－分子量))/(1 000×10)×100。

1.2.2 菌種活化將衛(wèi)星靈芝斜面菌種接入PDA綜合培養(yǎng)基中，于27℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，活化2～3代后備用。

1.2.3 菌種馴化以ZnSO4、Na2SeO3為供體，將活化后的衛(wèi)星靈芝菌株，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌塊，分別接種于含有不同濃度的硒或鋅的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，測(cè)量其菌落直徑，對(duì)比不同添加濃度下的PDA平板上菌絲體生長(zhǎng)情況。同時(shí)以未加硒或鋅元素的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

1.2.4 靈芝富集硒、鋅方法①單元素富集實(shí)驗(yàn):挑取馴化后發(fā)育良好的菌絲塊(直徑1.0 cm)于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二次馴化培養(yǎng)。按規(guī)定10%(體積比)接種量分別接入含有不同濃度硒、鋅的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、29℃恒溫培養(yǎng)46 h，按照1.2.1方法測(cè)定菌絲體干重、菌絲體中硒、鋅的含量及轉(zhuǎn)化率，確定鋅。以未加鋅、硒的培養(yǎng)基做空白對(duì)照;②二元素同步富集實(shí)驗(yàn):同上操作，將馴化培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液接種于同時(shí)含有一定濃度硒和鋅的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，測(cè)定菌絲體干重;稱(chēng)取一定量的菌絲體粉，用透析法去除菌絲體中游離的硒和鋅，按照1.2.1方法測(cè)定透析前后的菌絲體中硒、鋅的含量，考察液體發(fā)酵同步富集2種元素有機(jī)化程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化試驗(yàn)

2.1.1 不同亞硒酸鈉濃度對(duì)菌落形態(tài)影響分別以含亞硒酸鈉濃度為20、40、60、80、100、120、150、200、500 mg/L的PDA平板對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行馴化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明(表1):在試驗(yàn)范圍內(nèi)不同濃度的硒離子對(duì)平板上菌絲體的生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用，隨著濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，致死濃度為500 mg/L。當(dāng)培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度為80 mg/L時(shí)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲體密集性強(qiáng)，馴化后的靈芝菌絲較對(duì)照短粗、形態(tài)濃密，菌絲潔白。

2.1.2 不同鋅濃度對(duì)菌落形態(tài)的影響分別以含硫酸鋅濃度為20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、500 mg/L的PDA平板對(duì)衛(wèi)星靈芝菌株進(jìn)行馴化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明(表2):實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)培養(yǎng)基中適宜濃度的鋅離子對(duì)靈芝菌絲的生長(zhǎng)具有明顯促生長(zhǎng)作用，靈芝菌落直徑隨鋅濃度的增加而增大，當(dāng)鋅濃度達(dá)到150 mg/L時(shí)，菌落直徑達(dá)到最大，馴化效果也最好;馴化后的靈芝菌絲體較對(duì)照組潔白、粗壯、密集性強(qiáng)，菌絲較長(zhǎng)。而后隨著鋅濃度的增加菌落直徑逐漸減小，促生長(zhǎng)效果降低，鋅濃度大于300 mg/L時(shí)，對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，鋅濃度500 mg/L時(shí)培養(yǎng)基凝固效果不好，靈芝菌絲體無(wú)法生長(zhǎng)。

表1 不同濃度亞硒酸鈉馴化培養(yǎng)基中菌絲體的生長(zhǎng)情況Table 1 Mycelial growth in taming medium with different sodium selenite concentration

表2 不同濃度硫酸鋅馴化培養(yǎng)基中菌絲體的生長(zhǎng)情況Table 2 Mycelial growth in taming medium with different zinc sulfate concentration

2.2 亞硒酸鈉濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和富集硒效果的影響

分別在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20、40、60、80、100 mg/L的亞硒酸鈉，接種馴化后的液體菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。結(jié)果表明(表3):當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒時(shí)，對(duì)菌絲體生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用，生物量明顯低于對(duì)照組，但靈芝菌絲體的富硒量隨著硒濃度的增加而提高，但當(dāng)硒的濃度超過(guò)40 mg/L時(shí)，菌絲體生物量、富硒量最高，富集效果最好。

表3 硒濃度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)及富集的影響Table 3 Effect of selenium concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.3 鋅濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和富集鋅效果的影響

分別在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20、40、60、80、100、150、200 mg/L的硫酸鋅，接種馴化后的液體菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。由表4可以看出:當(dāng)培養(yǎng)基中鋅濃度低于150 mg/L的范圍內(nèi)對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，生物量明顯高于對(duì)照組，而菌絲體中的鋅含量隨著鋅濃度的增加而增加，當(dāng)培養(yǎng)基中的鋅濃度為60 mg/L，菌絲體中的鋅含量和富鋅轉(zhuǎn)化率最高。

表4 鋅濃度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)及富集的影響Table 4 Effect of zinc concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.4 液體培養(yǎng)同步富集鋅、硒實(shí)驗(yàn)

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加40 mg/L的亞硒酸鈉和60 mg/L的硫酸鋅，接種馴化后的液體菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，初步考察了靈芝液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體中鋅、硒的含量及轉(zhuǎn)化率，同時(shí)采用透析的方法對(duì)菌絲體中鋅、硒的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行了分析，見(jiàn)表5。初步的結(jié)果表明:當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)添加不同濃度的鋅和硒時(shí)，與單元素富集實(shí)驗(yàn)相比，菌絲體中硒、鋅的含量及富集轉(zhuǎn)化率均較低;透析后靈芝菌絲體對(duì)鋅的富集效率與硒相比，富集效率較低，透析前后的菌絲體中硒的含量和富集率變化不大，說(shuō)明靈芝菌絲體對(duì)無(wú)機(jī)硒的聚集主要是以有機(jī)硒的方式富集;而對(duì)無(wú)機(jī)鋅的富集結(jié)合狀態(tài)有無(wú)機(jī)和有機(jī)2種形式并存。

表5 液體深層發(fā)酵靈芝菌絲體同步富集鋅、硒的效應(yīng)Table 5 Simultaneous enrichment effect of zinc and selenium in SGL mycelium in liquid submerged fermentation

3 討論

靈芝菌種經(jīng)過(guò)無(wú)機(jī)鋅的馴化后，菌落形態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照組和無(wú)機(jī)硒實(shí)驗(yàn)組，菌落邊緣整齊，菌絲長(zhǎng)而粗壯、致密，色澤潔白，適當(dāng)濃度范圍的無(wú)機(jī)鋅對(duì)靈芝菌絲體的促生長(zhǎng)作用非常明顯，這主要緣于鋅與酶的關(guān)系極為密切，它決定并影響著160多種酶的活性，尤其對(duì)金屬酶具有催化性、結(jié)構(gòu)性和調(diào)節(jié)性功能。這些酶類(lèi)主要包括氧化還原酶(超氧化物歧化酶)、轉(zhuǎn)移酶(RNA聚合酶)、水解酶(堿性磷酸酶)、裂解酶(碳酸酐酶)及連接酶(tRNA合成酶)。鋅還是許多功能蛋白如金屬硫蛋白、核蛋白、受體等的組成成分，可直接參與核酸及蛋白質(zhì)合成，對(duì)細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)及再生作用重大。而無(wú)機(jī)硒在靈芝所能忍耐的硒濃度范圍內(nèi)，低濃度的硒對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)影響比較小，隨著硒濃度的增加抑制作用明顯增強(qiáng)，甚至引起毒害。

衛(wèi)星靈芝菌絲體具較強(qiáng)的富集硒、鋅的能力，液體深層發(fā)酵靈芝富硒菌絲體的最佳亞硒酸鈉濃度為40 mg/L，菌絲體生長(zhǎng)量1.54%，富硒量2 131.5 mg/kg，富硒率32.91%。最佳硫酸鋅濃度為60 mg/L，菌絲體生長(zhǎng)量1.76%，富鋅量為1 142.91 mg/kg，富鋅率為16.84%。培養(yǎng)基中同時(shí)添加40 mg/L亞硒酸鈉和60 mg/L硫酸鋅，透析前富硒量301.85 mg/kg，富硒率4.84%;富鋅量為540.41 mg/kg，富鋅率為5.72%;透析后富硒量295.86 mg/kg，富硒率4.75%;富鋅量為355.26 mg/kg，富鋅率為2.76%。

同步富集與單元素富集結(jié)果相比，靈芝菌絲體中的2種離子的含量及富集轉(zhuǎn)化率均較低，這是由于靈芝對(duì)鋅、硒的賦存形態(tài)主要是與靈芝蛋白組分相互結(jié)合，2種離子存在結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，所以富集結(jié)果明顯低于單元素富集效應(yīng)。另外，在同步富集實(shí)驗(yàn)中，衛(wèi)星靈芝富集硒元素的有機(jī)化程度較鋅元素高，透析前后的富硒率變化不大，這可能是由于2種離子在衛(wèi)星靈芝菌絲體中結(jié)合形式和參與代謝方式有關(guān)，如何提高同步富集硒、鋅的含量還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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