脂肪酶催化制備丁酸乙酯的研究

沈詠梅，謝曉娜，荀二娜，王佳欣，張 弘，王 磊，王 智

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春 130021; 3.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130023)

0 引言

丁酸乙酯是一種無(wú)色至微黃色透明液體，呈香蕉和菠蘿的特殊香味，其天然品主要存在于草莓、橄欖等植物油中.在食品工業(yè)中，丁酸乙酯主要被用來(lái)配制香蕉、葡萄、草毒、菠蘿和朗姆酒等香型的香料，此外，其在玫瑰油香精、煙用香精中亦有使用.在我國(guó)，它是GB2760－86規(guī)定允許使用的食用香料［1］.

目前，除了極少數(shù)的酯是由天然植物中提取以外，短鏈脂肪酸酯幾乎全部都是通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)方法進(jìn)行生產(chǎn)的，即在高溫、高壓條件下，由無(wú)機(jī)催化劑，如濃硫酸、對(duì)甲苯磺酸等催化合成.然而，化學(xué)生產(chǎn)不僅存在著催化劑可能帶來(lái)有毒物質(zhì)的問(wèn)題，而且劇烈的反應(yīng)條件也很容易產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物［2，3］.此外，采用微生物發(fā)酵方法也可以制備短鏈脂肪酸酯［4］，但該方法的主要缺點(diǎn)是產(chǎn)物的濃度低、代謝產(chǎn)物復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn).近年來(lái)，隨著科研人員對(duì)非水酶學(xué)研究的深入，酶在有機(jī)溶劑中催化功能的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，利用脂肪酶在有機(jī)相中具有較高酯化能力的特性，已經(jīng)出現(xiàn)一些利用該方法催化制備短鏈脂肪酸酯的比較成功的例子［5，6］.酶法制備短鏈脂肪酸酯具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)約能源、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)，而且其產(chǎn)品可以被認(rèn)作天然產(chǎn)物［7］.

在本研究中，我們采用脂肪酶BSL2(Bacillus subtilis lipase)作為催化劑，考察了由丁酸與乙醇在常壓下直接酯化合成丁酸乙酯的可行性，同時(shí)，對(duì)其最適反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選.

1 材料方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用脂肪酶BSL2由吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行克隆、表達(dá)［8］.丁酸、乙醇以及其他化學(xué)試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 脂肪酶BSL2粗酶制備

脂肪酶BSL2粗酶制備［8］的方法為:首先，將脂肪酶BSL2工程菌BSL按接種量的1%接種于硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上(5 mL，30 μg/mL)，恒溫30℃下振蕩培養(yǎng)20 h.然后，按1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基上(200 mL)，恒溫30℃振蕩培養(yǎng)4 h后轉(zhuǎn)接到2 L發(fā)酵LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)恒溫30℃培養(yǎng)并監(jiān)測(cè)其OD600值，當(dāng)培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí)，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離(8，000 rpm，15 min)，收集菌體，將其置于－20℃的溶器中，冷凍過(guò)夜.其后，在室溫下將菌體融化，加入pH值為8.5的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(約為菌體9倍體積)，同時(shí)加入溶菌酶(按1∶500(V/V)加入)，恒溫4℃下將其消化1 h后離心(4℃，12 000 rpm，20 min)分離，收上清液得脂肪酶BSL2粗酶液.最后，用硫酸銨(40%飽和度)對(duì)粗酶液進(jìn)行沉淀，所得到的上清液用硫酸銨(70%飽和度)進(jìn)行沉淀，沉淀溶解后透析過(guò)夜，凍干備用.

1.3 初始水活度(aw)的控制

初始水活度(aw)的控制［9］方式為，通過(guò)直接向反應(yīng)體系中加入水合鹽對(duì)來(lái)控制體系水活度，并在基本反應(yīng)體系中分別配置不同水活度為0.06(LiBr)、0.11(LiCl)、0.24(KCH3COO)、0.33(MaCl2)、0.53(Mg (NO3)2)、0.75(NaCl)和0.97(K2SO4)的反應(yīng)體系.

1.4 脂肪酶催化丁酸乙酯的酯合成反應(yīng)

脂肪酶催化丁酸乙酯的酯合成反應(yīng)過(guò)程為，在20 mL正丁烷中(含有20 mg硅藻土，aw=0.33)加入丁酸(40 mmol/L)、乙醇(60 mmol/L)和100 mg酶粉，置于40℃振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng).產(chǎn)物經(jīng)GC分析測(cè)定丁酸轉(zhuǎn)化率.酯合成反應(yīng)速度(μmol/g· min)定義為，單位酶(g)在單位時(shí)間(min)內(nèi)催化合成丁酸乙酯的量(μmol).

1.5 GC檢測(cè)方法

GC檢測(cè)方法為:島津GC214B型氣相色譜儀(GC)，Econo-CAP SE54毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm× 0.25 mm)，氫火焰檢測(cè)器;載氣N2(60 mL·min－1)，進(jìn)樣室溫度200℃，檢測(cè)室溫度290℃.升溫程序?yàn)?起始柱溫110℃，保留1 min，升溫速率15℃· min－1，最后溫度210℃，保留2 min;進(jìn)樣量2 μL.

2 結(jié)果與討論

影響脂肪酶在有機(jī)溶劑中催化合成丁酸乙酯反應(yīng)的因素有很多，除了選擇具有較高催化活性的脂肪酶之外，還有許多反應(yīng)條件因素需要考慮.

2.1 反應(yīng)介質(zhì)

有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響是非水酶學(xué)所要闡明的重要因素.溶劑不但直接或間接地影響酶的催化活力和穩(wěn)定性，而且也能夠改變酶的特異性(包括底物特異性、立體選擇性、前手性選擇性等)，有機(jī)溶劑主要通過(guò)與水、酶、底物和產(chǎn)物的相互作用來(lái)影響酶的這些性質(zhì)［10］.在實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了6種不同極性的有機(jī)溶劑，研究了反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響，結(jié)果如表1所示.

表1 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

表1數(shù)據(jù)表明，脂肪酶BSL2催化丁酸乙酯合成反應(yīng)的反應(yīng)速度隨著有機(jī)溶劑極性的增加而下降，在所選擇的6種有機(jī)溶劑中，正己烷作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)反應(yīng)速度最快.這可能是由于極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑具有較強(qiáng)的親水性，其剝奪酶分子必需水的能力較強(qiáng)，容易破壞酶分子的活性構(gòu)象，因此在這類有機(jī)溶劑中，酶的催化活力通常不會(huì)太高.

2.2 反應(yīng)溫度

一般來(lái)說(shuō)，反應(yīng)溫度越高反應(yīng)速度越快，但在高溫下酶分子作為一種蛋白質(zhì)容易變性失活.本研究考察了反應(yīng)溫度對(duì)于脂肪酶BSL2催化丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酯合成反應(yīng)速度隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)出“鐘"形曲線，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，脂肪酶BSL2催化合成丁酸乙酯的反應(yīng)速度最快.

2.3 底物濃度和底物摩爾比

由于丁酸和乙醇都是具有較強(qiáng)極性的有機(jī)化合物，它們的濃度有可能直接影響到酶的催化活性和穩(wěn)定性，并最終影響酶促反應(yīng)的反應(yīng)速度和轉(zhuǎn)化率，故本研究分別考察了底物濃度和底物摩爾比對(duì)該反應(yīng)的影響.

首先，固定丁酸濃度為40 mmol/L，通過(guò)改變反應(yīng)體系中的乙醇量來(lái)調(diào)節(jié)酸醇摩爾比，考察了底物摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 底物摩爾比對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)提高酸醇的摩爾比能夠提高酯合成反應(yīng)速度，而底物摩爾比太高則可能會(huì)抑制酶活，降低了反應(yīng)速度.

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最適酸醇摩爾比為1∶1.5.固定底物摩爾比(1∶1.5)，調(diào)節(jié)丁酸的濃度，考察丁酸濃度對(duì)酯合成反應(yīng)速度的影響，結(jié)果如圖3所示.

圖3 底物濃度對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)丁酸濃度為40 mmol/L的時(shí)候，反應(yīng)速度最快，進(jìn)一步增大其濃度，反應(yīng)速度開始下降，這可能是由于酶活被抑制的緣故.

2.4 加酶量的影響

不同加酶量對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)速度也會(huì)產(chǎn)生影響.本研究分別取10 mg、50 mg、100 mg、150 mg和200 mg酶粉進(jìn)行酶促酯合成反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示.

圖4 加酶量對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶促合成丁酸乙酯的反應(yīng)速度隨著酶量的增加而加快，當(dāng)酶量達(dá)到100 mg時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大，再增加酶其反應(yīng)速度不會(huì)增加.

2.5 初始水活度的影響

在含微量水的有機(jī)介質(zhì)中，酶的催化活性與反應(yīng)體系的含水量密切相關(guān)［11］.一般來(lái)說(shuō)，脂肪酶在完全無(wú)水的條件下是沒(méi)有催化活性的，因?yàn)槊感枰欢康乃拍芫S持其催化活性.在有機(jī)介質(zhì)中，微量水直接參與了酶的水化作用，影響酶的催化活性和穩(wěn)定性.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變反應(yīng)體系的水活度，并對(duì)此進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖5所示.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)系統(tǒng)初始水活度為0.33時(shí)，酯合成反應(yīng)速度最大.

圖5 水活度對(duì)對(duì)酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)的影響

2.6 酯化反應(yīng)進(jìn)程

在最適反應(yīng)條件下(以正己烷為溶劑，丁酸濃度為40 mmol/L，乙醇濃度為60 mmol/L，加人0.1 g脂肪酶，40℃，aw=0.33)進(jìn)行酶促丁酸乙酯合成反應(yīng)，監(jiān)測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間丁酸乙酯合成反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖6所示.

圖6 酶促合成丁酸乙酯的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯合成反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率不斷增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 h的時(shí)候，酯合成反應(yīng)基本達(dá)到平衡，此時(shí)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為94.8%.故確定最適反應(yīng)時(shí)間為30 h.

3 結(jié)論

本研究利用脂肪酶BSL2作為催化劑，在有機(jī)相中催化合成丁酸乙酯.在研究中，考察了反應(yīng)溫度、加酶量、底物濃度、底物摩爾比、反應(yīng)介質(zhì)、初始水活度等反應(yīng)條件對(duì)酶促合成丁酸乙酯的影響.試驗(yàn)結(jié)果表明，以正己烷為溶劑，初始水活度為0.33，加酶量為100 mg，丁酸濃度為40 mmol/L，底物摩爾比(丁酸/乙醇)為1∶1.5，在40℃條件下振蕩反應(yīng)30 h，合成丁酸乙酣的的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到94.8%.

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