基于與α－丙氨酸／天冬酰胺美拉德反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能研究

孫 濤， 朱 云， 謝 晶， 薛 斌， 周冬香

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306；2.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)研究院，上海，201306）

基于與α－丙氨酸／天冬酰胺美拉德反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能研究

孫 濤1，2， 朱 云1， 謝 晶1， 薛 斌1， 周冬香1

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306；2.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)研究院，上海，201306）

研究低聚殼聚糖（COS）與α－丙氨酸／天冬酰胺（低聚殼聚糖的羰基與氨基的物質(zhì)量比均為4：1）的美拉德反應(yīng)。醇沉法提取與α－丙氨酸／天冬酰胺反應(yīng)8、16 h以及24 h的低聚殼聚糖衍生物，分別記為：CA－8、CA－16、CA－24、CN－8、CN－16以及 CN－24。對(duì)衍生物進(jìn)行紅外表征，并研究其對(duì)超氧陽(yáng)離子O2.－、DPPH自由基的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示：美拉德反應(yīng)后低聚殼聚糖衍生物抗氧化能力得到顯著提高?？寡趸芰?qiáng)弱次序?yàn)镃A－8＞CN－8、CA－16＞CN－16、CA－24＞CN－24，即隨著反應(yīng)時(shí)間增加，低聚殼聚糖與α－丙氨酸美拉德反應(yīng)的衍生物抗氧化性始終更強(qiáng)，表明與小分子氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)制得的殼聚糖衍生物具有更好的抗氧化性。

低聚殼聚糖，α－丙氨酸，天冬酰胺，美拉德反應(yīng)，抗氧化性能

美拉德反應(yīng)是在食物中發(fā)生的主要反應(yīng)之一，它由還原性糖、醛或酮的羰基部分和氨基酸、蛋白質(zhì)或任何含氮化合物的胺基縮合產(chǎn)生。其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，與反應(yīng)時(shí)間、溫度以及參與反應(yīng)的糖和氨基酸等有很大關(guān)系［1］。研究表明，氨基酸的結(jié)構(gòu)和種類會(huì)影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的自由基清除能力［2］。

低聚殼聚糖可以作為羰基的供應(yīng)體與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)。本文研究了低聚殼聚糖與α－丙氨酸和天冬酰胺的美拉德反應(yīng)，制得低聚殼聚糖衍生物，考察了其對(duì)O2·－、DPPH的清除能力以及還原能力，為拓寬低聚殼聚糖的改性和開(kāi)發(fā)天然高效的抗氧化劑提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

低聚殼聚糖（純度＞90%，脫乙酰度約為70%，凝膠色譜測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為9 370），購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司；魯米諾，DPPH，購(gòu)自Sigma公司；α－丙氨酸，天冬酰胺，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)（滬試）；其余試劑均為分析純，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。

1.2 主要設(shè)備和儀器

WFZ UV2000型紫外分光光度計(jì)：上海合利儀器有限公司產(chǎn)品；970CRT熒光分光光度計(jì)：南京昕航科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；EQUNOX55傅立葉紅外－拉曼光譜儀：德國(guó)布魯克公司產(chǎn)品；IFFM 2D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀：西安瑞邁科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 低聚殼聚糖衍生物的制備

稱取低聚殼聚糖30.0 g兩份，分別加入α－丙氨酸0.652 5 g／天冬酰胺1.451 6 g，使得低聚殼聚糖羰基和α－丙氨酸／天冬酰胺的氨基物量比均為4∶1。用300 m L的二次蒸餾水溶解，在80℃下回流反應(yīng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)醇沉，制得與α－丙氨酸／天冬酰胺反應(yīng)8、16以及24 h的低聚殼聚糖衍生物，分別記為：CA－8、CA－16、CA－24、CN－8、CN－16以及 CN－24。

1.4 測(cè)試表征

紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外－拉曼光譜儀上進(jìn)行，采用KBr壓片法制樣，測(cè)定波數(shù)范圍為500～4 000 cm－1，分辨率為0.8 cm－1。

1.5 抗氧化性能測(cè)定

1.5.1 對(duì)超氧陰離子自由基O2·－的清除用p H＝10.20的0.05 mol／L Na2CO3－Na HCO3緩沖溶液配制濃度為1.5×10－3mol／L的魯米諾溶液，用1×10－3mol／L的鹽酸配制濃度為0.1 mol／L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液，使用前用去離子水稀釋至1×10－4mol／L。以緩沖液作為溶劑，配制不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液，讀出峰面積［3］。清除率＝（A0－Ai）／A0×100%。其中A0為空白溶液峰面積；Ai為樣品溶液峰面積。經(jīng)SOD，過(guò)氧化氫酶及甘露醇檢測(cè)，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子

1.5.2 對(duì)DPPH自由基的清除在比色管中加入2.0 m L的濃度為1×10－4mol／L DPPH無(wú)水乙醇溶液，再加入不同濃度的樣品溶液2.0 m L，室溫下避光靜置半小時(shí)，在517 nm處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無(wú)水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。清除率＝［1－（Ai－A j）／A0］×100%［4］。

1.5.3 還原能力的測(cè)定pH＝6.60的0.2 mol／L磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 m L，加入到2.0 m L不同濃度的樣品溶液中，混勻，置于50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 m L 10%三氯乙酸溶液，混勻后在3 000 r／min下離心10 min，取上清液 2.0 m L，加 入 2.5 m L 去 離 子 水 和 0.5 m L0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm處測(cè)定其吸光度［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚殼聚糖美拉德衍生物的測(cè)試表征

Maillard反應(yīng)產(chǎn)物比較復(fù)雜，一般都會(huì)生成類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物。低聚殼聚糖與α－丙氨酸／天冬酰胺發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)反復(fù)醇沉，可以洗去芳香類、雜環(huán)類等一系列小分子，紅外表明，醇沉所得產(chǎn)物具有COS的特征結(jié)構(gòu)，故初步認(rèn)定為低聚殼聚糖衍生物。

圖1是低聚殼聚糖及其衍生物（反應(yīng)24 h）的紅外光譜圖。殼聚糖及兩種衍生物在1100 cm－1附近都有3個(gè)較強(qiáng)的多糖特征吸收峰，分別是895、1 085以及1 155 cm－1，這些吸收峰都來(lái)自殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可作為判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰［3］。低聚殼聚糖在1 621、1 515和1 381 cm－1附近的吸附帶，分別歸因于酰胺I（C＝O）、自由氨基（－NH2）和酰胺Ⅲ［6］。且CA和CN在1 621、1 515和1 381 cm－1的峰較低聚殼聚糖有所增強(qiáng)或降低，表明了酰胺I（C＝O）、自由氨基（－NH2）和酰胺Ⅲ的改變［7］，即低聚殼聚糖在美拉德反應(yīng)后結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖1 低聚殼聚糖以及兩種低聚殼聚糖美拉德衍生物（反應(yīng)24 h）的紅外圖Fig.1 FTIR spectra of COS，CA－24 and CN－24

2.2 超氧陰離子自由基的清除

圖2 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)8 h）對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.2 Scavenging activities of COS，CA－8，CN－8 on superoxide anion

圖3 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)16 h）對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.3 Scavenging activities of COS，CA－16，CN－16 on superoxide anion

圖4 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)24 h）對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.4 Scavenging activities of COS，CA－24，CN－24 on superoxide anion

2.3 對(duì)DPPH自由基的清除

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱。低聚殼聚糖分子鏈中的活性氨基和羥基可以提供氫與DPPH結(jié)合，從而達(dá)到清除 DPPH 的目的［4］。

由圖可知，反應(yīng)時(shí)間不同的6種低聚殼聚糖衍生物DPP自由基的清除能力均優(yōu)于低聚殼聚糖，即抗氧化能力CA－8＞CN－8＞COS、CA－16＞CN－16＞COS、CA－24＞CN－24＞COS。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除能力與體系的熒光值有一定關(guān)系［9］。本實(shí)驗(yàn)表明，殼聚糖衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力與反應(yīng)過(guò)程中熒光值的變化結(jié)果一致。這與對(duì)的清除效果保持一致。

圖5 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)8 h）對(duì)DPPH的清除能力Fig.5 Scavenging activities of COS，CA－8，CN－8 on DPPH radicals

圖6 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)16 h）對(duì)DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging activities of COS，CA－16，CN－16 on DPPH radicals

圖7 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)24 h）對(duì)DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging activities of COS，CA－24，CN－24 on DPPH radicals

2.4 還原能力的測(cè)定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，通過(guò)提供電子，阻斷Fe2＋向Fe3＋的轉(zhuǎn)變，從而表現(xiàn)出一定的還原能力。研究表明，抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系［10］。

圖8、9、10描述了低聚殼聚糖及其衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖可知，6種低聚殼聚糖衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力均優(yōu)于低聚殼聚糖，即抗氧化能力CA－8＞CN－8＞COS、CA－16＞CN－16＞COS、CA－24＞CN－24＞COS。這與前面結(jié)果保持一致。

圖8 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)8 h）的還原能力測(cè)定Fig.8 Reducing power of COS，CA－8，CN－8

圖9 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)16 h）的還原能力測(cè)定Fig.9 Reducing power of COS，CA－16，CN－16

美拉德反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有抗氧化性的物質(zhì)，其中某些有抗氧化性的小分子物質(zhì)可能生成、積累或者揮發(fā)，也可能聚合成抗氧化性較好的大分子物質(zhì)，如類黑素等。通過(guò)美拉德反應(yīng)制備3種低聚殼聚糖衍生物，盡管消耗了活性氨基，但其衍生物的抗氧化性卻得到了較大的提升，其機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

圖10 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物（反應(yīng)24 h）的還原能力測(cè)定Fig.10 Reducing power of COS，CA－24，CN－24

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)研究了低聚殼聚糖與α－丙氨酸和天冬酰胺的美拉德反應(yīng)，并檢測(cè)了低聚殼聚糖及其衍生物對(duì)O2.－、DPPH的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示，6種低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性均優(yōu)于低聚殼聚糖，故可以認(rèn)為美拉德反應(yīng)是低聚殼聚糖改性的有效手段；隨著反應(yīng)時(shí)間增加，低聚殼聚糖與α－丙氨酸美拉德反應(yīng)的衍生物抗氧化性始終優(yōu)于低聚殼聚糖與天冬酰胺美拉德反應(yīng)的衍生物，這可能是由于α－丙氨酸的分子較天冬酰胺小，更易于向羰基進(jìn)攻發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成的衍生物抗氧化性能也更強(qiáng)。表明低聚殼聚糖與葡萄糖的美拉德反應(yīng)是提高抗氧化性更有效的手段，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究為制備天然、安全、高效的抗氧化劑提供了很好的思路。

（References）：

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The Antioxidant Activity of the Chitosan Oligosaccharide Derivatives by Maillard Reaction Between Chitosan Oligosaccharide andα－alanine／Asparagine

SUN Tao1，2，ZHU Yun1，XIE Jing1，XUE Bin1，ZHOU Dongxiang1

（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai，201306；2.Institute of Marine Science，Shanghai Ocean University，Shanghai，201306）

In this study，six kinds of the chitosan oligosaccharide derivatives，named CA－8，CA－16，CA－24，CN－8，CN－16 and CN－24were prepared though Maillard reaction by heating chitosan oligosaccharide andα－alanine／asparagine（the ratio of carbonyl group and amino group was 4：1）at different time.Then，the antioxidant activity of those derivatives was investigated with superoxide anion radical／1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging and reducing power and index.The results indicated that the chitosan oligosaccharide derivatives exhibited more strong antioxidant activity than that of chitosan oligosaccharide.Furthermore，the derivatives from chitosan oligosaccharide withα－alanine had the better antioxidant activity than that of the derivatives prepared by chitosan oligosaccharide and asparagine.The reason is that the derivatives prepared by chitosan oligosaccharide and amino acid with the smaller molecule had the better antioxidant activity.

book=0,ebook=258

chitosan oligosaccharide，α－alanine，asparagines，Maillard reaction，antioxidant activity

Q539

A

1673－1689（2012）05－0531－06

2011－06－27

上海市生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域重點(diǎn)科技項(xiàng)目（08391911500）；2009年上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃（09XD1402000）；上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（J50704）。

孫濤 （1970－），女，黑龍江依蘭人，理學(xué)博士，副教授，主要從事多糖的改性及生物功能的開(kāi)發(fā)。E－mail：taosun＠shou.edu.cn