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    云南省家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突變的研究

    2012-01-09 05:03:18武治國(guó)陳明清
    實(shí)用癌癥雜志 2012年4期
    關(guān)鍵詞:證者家系外顯子

    武治國(guó) 陳明清

    大腸癌是世界上高發(fā)惡性腫瘤之一,歐美國(guó)家大腸癌的發(fā)病率排在惡性腫瘤的第2位,在中國(guó)為第4~6位,近年更有上升趨勢(shì)[1]。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)和遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancers,HNPCC)是遺傳性大腸癌的2種主要類型,其中FAP典型的臨床表現(xiàn)為患病者從青春期開始結(jié)直腸黏膜出現(xiàn)彌漫性腺瘤性息肉,如不進(jìn)行及時(shí)恰當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)干預(yù),將在30歲左右發(fā)展成為結(jié)直腸癌,是導(dǎo)致FAP患者死亡的第一位原因[2~4]。目前臨床上,F(xiàn)AP患者的確診多數(shù)依賴?yán)w維結(jié)腸鏡的檢查,但發(fā)現(xiàn)時(shí)一般較晚,無法提供早期診斷。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,F(xiàn)AP相關(guān)致病基因突變篩查可以提供臨床前期診斷,有助于早期預(yù)防及治療。近年來,云南地區(qū)大腸癌發(fā)病率成上升趨勢(shì)[5],且云南人群FAP相關(guān)致病基因研究鮮見報(bào)道,本研究針對(duì)云南省FAP患者相關(guān)致病基因APC基因胚系突變,初步探討該地區(qū)FAP患者致病基因突變特點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    10個(gè)FAP家系先證者(漢族7例,彝族2例,白族1例)分別來自云南省昆明市、昭通市、大理州、紅河州,均經(jīng)手術(shù)和(或)家族史證實(shí)為FAP(或伴癌變)患者。經(jīng)患者同意后由其介紹和引導(dǎo)其直系和旁系各級(jí)親屬進(jìn)行遺傳學(xué)咨詢,并以先證者為中心繪制3代以上家系圖譜(圖1)。

    圖1 云南省10個(gè)FAP家系圖譜

    1.2 基因突變檢測(cè)方法

    1.2.1 DNA提取 獲取書面知情同意書后,抽取10名先證者及其家系成員外周靜脈血各5 ml,以0.5 mmol/L 1 ml的EDTA抗凝。應(yīng)用QIAamp DNA抽提試劑盒(Qiagen,Germany)按照試劑盒說明書提取DNA,應(yīng)用分光光度法測(cè)定DNA濃度及純度,-20℃冰箱冷藏備用。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)APC基因各外顯子的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物共35對(duì),由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在MyCycler PCR儀(Bio-RaD,USA)上進(jìn)行,反應(yīng)總體積為30 μL∶100 ng基因組DNA,1×PCR緩沖液,2.5 mM MgCl2,10 mM dNTP,正向和反向引物各3.3 μM,1U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)稍加調(diào)整:95℃預(yù)變性5 min(1個(gè)循環(huán));95℃變性30 s,57℃~61℃退火(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)各引物退火溫度)30 s,72℃延伸30 s(35個(gè)循環(huán));72℃最終延伸10 min (1個(gè)循環(huán))。

    1.2.4 DNA測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后上ABI PRISMTM-3730XL DNA測(cè)序儀 (Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)進(jìn)行雙向DNA測(cè)序,測(cè)序引物與PCR引物相同,測(cè)序試劑為BigDyeRTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit。

    1.2.5 測(cè)序分析 應(yīng)用Chromas 2.3軟件分析測(cè)序結(jié)果,參考美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上APC基因序列(NM-000038),進(jìn)行序列比對(duì)。

    2 結(jié)果

    2.1 DNA提取結(jié)果

    應(yīng)用分光光度法測(cè)定DNA濃度:40~100 ng/μL;純度:OD260/OD280=1.6~1.8。

    2.2 PCR擴(kuò)增效果

    2%瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示,APC基因15個(gè)外顯子均得到成功擴(kuò)增,PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一區(qū)帶,大小與預(yù)計(jì)擴(kuò)增一致。

    2.3 DNA測(cè)序結(jié)果

    2.3.1 APC基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP) 對(duì)10個(gè)FAP家系先證者APC基因全編碼區(qū)行突變檢測(cè),檢出漢族J家系先證者APC基因發(fā)生無義突變,其他的6個(gè)漢族和3個(gè)少數(shù)民族家系中未發(fā)現(xiàn)APC基因致病性突變,僅檢測(cè)出SNP,包括Y486Y、T1493T、G1678G、D1822V、S1756S、P1960P。經(jīng)http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp網(wǎng)站上SNP數(shù)據(jù)查對(duì),為正常人群中常見突變,均屬于SNP,考慮為非致病突變。

    2.3.2 APC基因致病性突變 漢族J家系先證者APC基因檢測(cè)出無義突變(圖2),因APC基因上核苷酸3587C>A,導(dǎo)致15外顯子密碼子1196從編碼絲氨酸(Ser)變?yōu)榻K止密碼子(S1196X),因終止密碼子提前出現(xiàn),從而使APC蛋白呈截短改變。經(jīng)APC基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.umd.be/APC和http://www.china-hvp.org/LOVD/home.php?%20select_db=APC)查對(duì),國(guó)外有此突變報(bào)道,但國(guó)內(nèi)尚未見此突變的相關(guān)報(bào)道。此外,該家系還檢出位于15外顯子T1493T、G1678G、D1822V、P1960P的突變,屬于SNP,考慮為非致病突變。

    圖2 家族性腺瘤性息肉病患者J家系A(chǔ)PC基因測(cè)序圖箭頭表示在此點(diǎn)為單核苷酸突變APC基因c.3587C>A

    根據(jù)J家系先證者APC基因核苷酸3587C>A這一突變位點(diǎn),篩查該家系其他8名成員,7人檢出此突變(圖1-J家系),并經(jīng)結(jié)直腸鏡檢查證實(shí),成員Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4均發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸數(shù)百個(gè)息肉;成員Ⅲ2、Ⅲ3分別為18和16歲,在降結(jié)腸和直腸部位可見十幾個(gè)息肉;Ⅲ4僅12歲,腸鏡未檢查出息肉,為基因突變攜帶者;成員Ⅲ1未攜帶這一突變,鏡下未見息肉。Ⅰ2于1991年在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行全結(jié)腸切除術(shù),Ⅱ2在昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受預(yù)防性全結(jié)腸切除手術(shù)。

    3 討論

    3.1 FAP家系進(jìn)行致病基因檢測(cè)的意義及方法

    FAP是1種常染色體顯性遺傳病,位于5q21的APC基因突變是其發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。自1986年Herrera首次報(bào)道APC基因后,此基因的結(jié)構(gòu)及功能被認(rèn)識(shí)的越來越深入,其編碼的APC蛋白有多個(gè)功能區(qū)域,直接參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑,并在細(xì)胞-細(xì)胞間黏附、細(xì)胞骨架的微管穩(wěn)定、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[7],到目前為止,已發(fā)現(xiàn)APC基因致病突變超過700多種[8]。此次研究的10個(gè)家系,均進(jìn)行了至少3代的家系調(diào)查,其中D家系和G家系中的患者無明確的家族史,考慮是新發(fā)患者,與文獻(xiàn)報(bào)道20%的FAP病例無家族史相一致[9]。無論是新發(fā)FAP患者還是有家族史的FAP患者,都符合孟德爾遺傳定律,他們的子代都有50%的可能通過遺傳而攜帶突變的基因,因此,對(duì)FAP家系成員進(jìn)行突變基因篩查具有重要意義。

    3.2 云南地區(qū)FAP家系A(chǔ)PC基因突變分析

    在檢測(cè)出有APC基因突變的J家系中,APC基因由第15外顯子上1196密碼子從編碼絲氨酸變?yōu)榻K止密碼子(S1196X),由于是終止密碼子提前出現(xiàn),使APC蛋白呈截短改變,這種截短的APC蛋白丟失了其氨基端相當(dāng)一部分的氨基酸序列,從而喪失其抑制腫瘤發(fā)生的生物學(xué)功能而引發(fā)腫瘤。隨后對(duì)其家系另外8名成員行該突變位點(diǎn)的檢測(cè),其中7名成員有此突變,除一名12歲的基因突變攜帶者,由于未到發(fā)病年齡沒發(fā)現(xiàn)息肉外,其他突變成員均經(jīng)腸鏡檢查出息肉。因此,APC基因S1196X突變是引起這一FAP家系發(fā)病的原因,并且,通過對(duì)這一家系成員進(jìn)行基因篩查,發(fā)現(xiàn)了早期的FAP患者Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅲ2、Ⅲ3及無臨床表現(xiàn)的致病基因攜帶者Ⅲ4,早期給予醫(yī)學(xué)干預(yù)。

    此次對(duì)云南省10個(gè)FAP家系的APC基因進(jìn)行分析,僅檢出1個(gè)漢族家系有APC基因致病突變,突變檢出率遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)、外報(bào)道[9~14]的23.3%~78.6%和48%~87.7%。這次研究中,我們沒能確定其余9個(gè)家系的致病原因,其APC基因突變低檢出率可能的原因考慮有以下3個(gè)方面:第一,F(xiàn)AP患者APC基因突變率可能會(huì)存在著民族間、地域間的差異。由于不同民族不同地區(qū)的人群,其遺傳物質(zhì)本身存在差異或長(zhǎng)期地理隔離造成的生存環(huán)境的差異而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的差異,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有報(bào)道已提示FAP患者APC基因的檢出率在不同人種、不同地區(qū)存在差異。云南是個(gè)多民族的邊疆省份,包括漢族和彝、白、回、苗、傣、傈僳、哈尼等25個(gè)少數(shù)民族以多民族大雜居、小聚居分布為特點(diǎn),具有不同民族遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性和民族背景的單一性,APC基因突變的低檢出率有可能存在云南省地區(qū)差異的因素。第二,APC基因突變陰性的FAP患者是否存在其他致病基因和修飾基因的突變。有學(xué)者報(bào)道[15],在未檢出APC基因突變的FAP患者中,堿基剪切修復(fù)基因MYH (MutY human homologue,MYH)基因突變有25%的檢出率。Renkonen等[16]在未檢測(cè)到APC基因變異的FAP患者中,也指出有MYH或AXIN2基因的變異。FAP患者除與APC基因突變有關(guān)外,可能還存在其他發(fā)病機(jī)制。第三,APC基因突變可能存在于這些家系中,但目前檢測(cè)方法的限制,無法檢測(cè)出突變部位及類型。最近,有學(xué)者報(bào)道衰減型FAP(attenuated FAP,AFAP)患者內(nèi)含子突變,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄時(shí)剪切位點(diǎn)發(fā)生變化。Neklason等[17]報(bào)道1例AFAP患者4號(hào)內(nèi)含子突變導(dǎo)致APC基因4號(hào)外顯子表達(dá)缺失。我們這次研究應(yīng)用DNA直接測(cè)序方法,對(duì)FAP患者APC基因的全編碼區(qū)(15個(gè)外顯子)進(jìn)行檢測(cè),內(nèi)含子未在檢測(cè)范圍內(nèi)。另外,DNA直接測(cè)序?qū)虼笃稳笔Щ蛘麄€(gè)外顯子的缺失目前無法檢出。雖然APC基因的大片段缺失在FAP患者中不超過2%[14,18],內(nèi)含子突變致病的報(bào)道也很罕見,但這些也可能是造成我們研究中APC基因突變低檢出率的原因。

    因此,對(duì)于FAP患者的基因篩查除主要的致病基因APC基因外,其他一些候選基因和修飾基因還需進(jìn)一步深入研究,F(xiàn)AP基因篩查策略仍需進(jìn)一步完善[19]。

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