雷公藤多甙誘導(dǎo)SCID小鼠體內(nèi)HL-60細(xì)胞凋亡的研究

唐加明 梁國(guó)華 陳曉昀 朱玉峰

中藥雷公藤具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，常用于治療自身免疫性疾病。文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤還有抗腫瘤作用[1]。我們體外研究顯示雷公藤多甙對(duì)HL-60細(xì)胞有明顯地誘導(dǎo)凋亡作用，表明雷公藤多甙在體外實(shí)驗(yàn)中具有抗白血病活性[2]。但是，在體外實(shí)驗(yàn)中具有抗腫瘤活性的藥物在體內(nèi)抗腫瘤效果并不確定。因此，本研究通過構(gòu)建重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60細(xì)胞白血病模型，觀察雷公藤多甙在體內(nèi)對(duì)白血病細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

3～4周齡、雌性、SPF級(jí)SCID小鼠30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠在層流架內(nèi)帶蓋鼠盒中飼養(yǎng)(符合 SPF標(biāo)準(zhǔn))。

1.3 試劑與儀器

雷公藤多甙為上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠產(chǎn)品。TUNEL試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每周換液2次。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行移植。

1.5 SCID小鼠人HL-60細(xì)胞白血病模型的建立

SCID小鼠移植前未作任何處理。取體外培養(yǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞用于移植，用生理鹽水洗滌2次后，每只鼠從靜脈接種3×106個(gè)細(xì)胞。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

用生理鹽水溶解雷公藤多甙。30只小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：①雷公藤多甙組：于成功接種后第22天開始，每只小鼠腹腔注射雷公藤多甙1 mg/(kg·d)，終體積為0.2 ml/d×10天；②模型組：于成功接種后第22天開始，每只小鼠連續(xù)10天腹腔注射生理鹽水0.2 ml/d；③空白組：未接種HL-60細(xì)胞，與上述兩組同時(shí)開始腹腔注射等量生理鹽水。

1.7 生存情況觀察

記錄各組小鼠的一般情況。白血病小鼠(模型組及雷公藤多甙組)的生存期從接種當(dāng)日開始計(jì)算。

1.8 血象觀察

剪尾采血，行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。涂片，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并分類。

1.9 脾臟病理及細(xì)胞凋亡檢測(cè)

斷頸處死小鼠，迅速取其脾臟，常規(guī)操作制成病理切片，觀察病理形態(tài)改變。按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)脾臟細(xì)胞凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血象改變

經(jīng)尾靜脈接種HL-60細(xì)胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出現(xiàn)了與體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞形態(tài)類似的白血病細(xì)胞見表1。給藥10天后，與模型組比較，雷公藤多甙組外周血白細(xì)胞總數(shù)及白血病細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，見表2。

2.2 脾臟病理改變

病程后期，模型組小鼠脾臟中可見大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，雷公藤多甙組小鼠脾臟中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕。

2.3 脾臟細(xì)胞凋亡率

空白組小鼠脾臟內(nèi)未見凋亡細(xì)胞。模型組細(xì)胞凋亡率為(7.2±1.5)%，雷公藤多甙組與模型組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增高(21.6±2.4)%，P<0.05。

2.4 生存期比較

與未接種HL-60細(xì)胞的小鼠相比，晚期白血病小鼠均有不同程度地體重下降、精神不振、食欲下降、懶動(dòng)、行走不穩(wěn)等表現(xiàn)。與模型組比較，雷公藤多甙組的一般情況較好，生存期明顯延長(zhǎng)[(38.2±4.1)d，(52.6±5.3)d]，P<0.05。

表1 SCID 小鼠接種HL -60細(xì)胞后血象變化(%)

表2 雷公藤多甙給藥10天后白血病小鼠血象情況(%)

* 為與模型組比較，P<0.05

3 討論

雷公藤多甙是衛(wèi)矛科雷公藤根經(jīng)去皮、提取而成的1種中成藥，臨床上主要用于自身免疫性疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤還有抗腫瘤作用。雷公藤對(duì)L615，L1210以及P388白血病細(xì)胞和來自人體鼻咽癌(KB)細(xì)胞均有抑制作用。雷公藤對(duì)人白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞軟瓊脂中集落形成也有抑制作用。雷公藤的抗腫瘤成分主要有雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內(nèi)脂和雷公藤酮等[1]。近來，中國(guó)科學(xué)院與美國(guó)合作，經(jīng)抗癌機(jī)理研究，證實(shí)雷公藤紅素具有抗癌蛋白酶體抑制作用，能誘發(fā)前列腺癌和白血病的癌細(xì)胞凋亡[3]。最近研究還發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對(duì)逆轉(zhuǎn)K562 /A02 細(xì)胞的耐藥性有一定的作用[4]，臨床研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙能治療子宮肌瘤[5]。陸介芳等[6]用雷公藤的提取物雷公藤多甙治療1例對(duì)瘤可寧及COP方案治療無效的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者，結(jié)果獲得顯效。我們體外研究顯示雷公藤多甙對(duì)HL-60細(xì)胞有明顯誘導(dǎo)凋亡作用，后來國(guó)內(nèi)其他作者研究也得出類似結(jié)果,表明雷公藤多甙在體外實(shí)驗(yàn)中具有抗白血病活性[7～9]。但是，很多在體外實(shí)驗(yàn)中具有抗腫瘤活性的藥物在體內(nèi)抗腫瘤效果并不確定，需要進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來明確。

重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠是美國(guó)Bosma證實(shí)的屬CB-17近交系小鼠第16號(hào)常染色體發(fā)生隱性突變基因(SCID)的突變型小鼠。純合的SCID鼠基因?qū)е滦∈髱缀跬耆珕适和B淋巴細(xì)胞的功能，因此，這類小鼠是用于建立移植性人腫瘤模型的理想動(dòng)物[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)尾靜脈接種HL-60細(xì)胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出現(xiàn)了與體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞形態(tài)類似的白血病細(xì)胞。病程后期，模型組小鼠的脾臟中可見大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。與未接種HL-60細(xì)胞的小鼠相比，至發(fā)病晚期，白血病小鼠均有不同程度的體重下降、精神不振、食欲下降、懶動(dòng)、行走不穩(wěn)等一般情況差的表現(xiàn)。這些證據(jù)表明，本研究成功建立了重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60細(xì)胞白血病模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的類似[10]。進(jìn)一步應(yīng)用該模型進(jìn)行體內(nèi)研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雷公藤多甙組小鼠的外周血白細(xì)胞總數(shù)及白血病細(xì)胞數(shù)均明顯減少、脾臟中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕、脾臟細(xì)胞凋亡率明顯增高、一般情況較好、生存期明顯延長(zhǎng)。這些證據(jù)表明，雷公藤多甙在體內(nèi)具有抗白血病作用，其機(jī)制是通過誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，其潛在抗白血病的臨床應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步開發(fā)。

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