TGF-β1對白血病KG-1細(xì)胞株Gli1表達(dá)的影響

李 哲，潘 靜

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，遼寧錦州 121000)

Hedgehog(HH)信號通路在組織的損傷與修復(fù)中可以促使正常干細(xì)胞自我更新，因其過度激活可誘使正常干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]，近年來備受關(guān)注。最近的研究認(rèn)為，HH信號通路是白血病干細(xì)胞所需的功能性通路，這一通路的失活將阻礙白血病的進(jìn)展[2]。

Gli是HH信號通路的最后效應(yīng)階段，一直以來 Gli 都作為 HH 通路的下游基因參與腫瘤發(fā)生。最近關(guān)于Gli非經(jīng)典激活機(jī)制的研究表明，Gli 分子可能是幾種信號通路所共同整合交織的平臺，多種機(jī)制可以調(diào)控Gli的活性[3]。最近研究表明，在正常成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞系，Gli不僅受HH/Smo信號的調(diào)控，也受其他途徑的調(diào)控，比如TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這種調(diào)控是獨(dú)立于Ptch/Smo途徑的[4]。TGF-β作為非常重要的腫瘤抑制因子，對多種惡性腫瘤細(xì)胞的增生有明顯的抑制作用。James等[5]研究證實(shí)，TGF-β對白血病細(xì)胞的增生具有抑制作用，可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成熟，而在急性白血病患者中TGF-β水平降低，促使腫瘤細(xì)胞過度增生，對急性白血病的發(fā)生起促進(jìn)作用。

為了尋找白血病治療的新的靶點(diǎn)，筆者假設(shè)在白血病中同樣存在有TGF-β信號通路對Gli的調(diào)控，進(jìn)行了TGF-β1對KG-1細(xì)胞Gli1表達(dá)影響的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 KG-1細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 重組人細(xì)胞因子TGF-β1(Pepro Tech)；SIS3(Merck Company)；PCR引物合成(大連寶生物公司);RT-PCR試劑盒(杭州博日科技有限公司)；Real Time RT-PCR試劑盒(TaKaRa Japan)；Rotor-Gene 6000實(shí)時定量PCR儀(德國Qiagen公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)。

1.3方法

1.3.1Real Time PCR檢測KG-1細(xì)胞Gli1 mRNA的表達(dá) cDNA合成：所培養(yǎng)的KG-1細(xì)胞總RNA的提取按照Trizol Reagent說明書進(jìn)行操作，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系如下:5×RT緩沖液2 μL，dNTP Mixture(10 mmol)1 μL，Random Hexamer Primer 0.5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，實(shí)驗(yàn)樣品RNA 1 μL，RNase Free H2O 4.5 μL，于25 ℃靜置10 min,45 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

Real Time PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)：采用SYBR Prem ix Ex TaqTMKit(TaKaRa公司)進(jìn)行定量PCR,反應(yīng)體系如下:SYBR Primx Ex Taq12.5 μL,PCR Forward Primer(10 μmol)0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol)0.5 μL,cDNA 2 μL,dH2O 9.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 1 min預(yù)變性1次，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)反應(yīng)40次。待測樣品每管重復(fù)3次。在Rotor-Gene 6000實(shí)時定量PCR儀(德國QIAGEN公司)上進(jìn)行。PCR引物的序列,Gli1(sense 5′-CCC AAT CAC AAG TCA GGT TCC T-3′,antisense 5′-CCT ATG TGA AGC CCT ATT TGC C-3′),ABL(sense 5′-CGA GAG CCT GGC CTA CAA CAA-3′,antisense 5′-CTA GCA GCT CAT ACA CCT GGG ACA-3′)。采用Comparative Delta-delta Ct法計(jì)算Gli1的表達(dá)。

1.3.2PCR反應(yīng)判定KG-1細(xì)胞是否表達(dá)Ptch和Smo 提取KG-1細(xì)胞的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并應(yīng)用Ptch和Smo的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR引物的序列,Ptch(sense 5′-CTG TTG GCA TAG GAG TGG AGT TCA CC-3′,antisense 5′-CTG CTG GGC CTC GTA GTG CCG AAG C-3′),Smo(sense 5′-CAG AAC ATC AAG TTC AAC AGT TCA GGC-3′,antisense 5′-ATA GGT GAG GAC CAC AAA CCA AAC CAC ACC-3′),反應(yīng)體系如下:10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(10 mmol)0.5 μL,上游特異性引物(5 μmol)0.5 μL,下游特異性引物(5 μmol)0.5 μL,Taq mix DNA polymerase 0.5 μL,RT產(chǎn)物2.5 μL,ddH2O 18 μL,總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳條件：電流160 mA，電泳25 min后，并通過凝膠圖像分析儀觀察是否有相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，組間比較用單因素方差分析，多個樣本的均數(shù)比較用LSD方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1對KG-1細(xì)胞Gli1表達(dá)的影響 0.1 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞6、12、24 h后，Real Time-PCR結(jié)果顯示KG-1細(xì)胞的Gli1表達(dá)與對照組相比沒有明顯變化；而1 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TGF-β1分別作用于KG-1細(xì)胞6、12、24 h后，Real Time-PCR結(jié)果顯示,KG-1細(xì)胞的Gli1表達(dá)與對照組相比，明顯低于對照組；而且隨作用時間的延長，作用更加明顯；1 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TGF-β1對KG-1細(xì)胞Gli1表達(dá)的影響沒有明顯差異，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用兩組間近似平均濃度5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞,見圖1。

*：與對照組相比，P<0.05。

圖1不同濃度TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞后不同時間Gli1的mRNA表達(dá)變化

2.2TGF-β1、SIS3對KG-1細(xì)胞Gli1表達(dá)影響 因1～10 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞后可引起Gli1的表達(dá)減少，且1 ng/mL TGF-β1組和10 ng/mL TGF-β1組之間沒有明顯差異，故應(yīng)用其近似平均值5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞，Real Time-PCR結(jié)果顯示，5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞24 h，Gli1 的mRNA及蛋白表達(dá)較對照組明顯降低；Western blotting結(jié)果顯示，5 ng/mL TGF-β1聯(lián)合5 μmol SIS3作用于KG-1細(xì)胞24 h后，其Gli1的mRNA及蛋白表達(dá)較對照組明顯增高，見圖2。

A：TGF-β1組Gli1 mRNA表達(dá)較對照組降低；TGF-β1聯(lián)合SIS3組Gli1 mRNA表達(dá)較對照組明顯增高。*：P<0.05，與空白對照組相比。B：TGF-β1組Gli1蛋白表達(dá)較對照組降低；TGF-β1聯(lián)合SIS3組Gli1的蛋白表達(dá)較對照組增高。

圖2 TGF-β1、SIS3對KG-1細(xì)胞Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3PCR反應(yīng)判定KG-1細(xì)胞是否表達(dá)Ptch和Smo 見圖3。

圖3 KG-1細(xì)胞與對照組的白血病患者相比較，均沒有Ptch和Smo基因的表達(dá)

3 討 論

HH基因的作用涉及細(xì)胞的增生分化和組織發(fā)育。眾多研究表明該通路與包括白血病在內(nèi)的多種腫瘤性疾病相關(guān)，因此，抑制該通路有可能成為腫瘤預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。HH信號分子首先作用于受體蛋白Ptch家族，并激活Smo，進(jìn)而促使 Gli轉(zhuǎn)變成催化劑形式，進(jìn)入細(xì)胞核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。Gli包括3個同源基因，Gli1、Gli2、Gli3，其中Gli1起激活作用[6]。Gli分子本身與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展并沒有直接關(guān)系，但直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移的分子基因轉(zhuǎn)錄水平則受到HH信號通路調(diào)控，可能是該通路導(dǎo)致腫瘤的關(guān)鍵因素。

在造血系統(tǒng)中，HH的家庭成員在體外和體內(nèi)的干或(祖)細(xì)胞擴(kuò)增中起重要的調(diào)節(jié)作用。在一些白血病細(xì)胞系中對HH信號的成分進(jìn)行檢測，如Ptch和Smo可在Jurkat細(xì)胞中表達(dá)[7]，Gli1可在HL-60細(xì)胞和KG-1細(xì)胞中表達(dá)，Gli2在KG-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞中表達(dá)[8]。類似于HH信號通路，TGF-β在炎癥、組織修復(fù)、血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化等復(fù)雜過程中發(fā)揮了重要作用，其中TGF-β1生物活性最為強(qiáng)，在造血調(diào)控方面起重要作用[9]。

雖然有許多的研究表明，HH通路的異?；罨谠S多惡性腫瘤里存在，但在結(jié)腸癌細(xì)胞系的研究卻發(fā)現(xiàn)很多HH通路的關(guān)鍵分子并沒有檢測到表達(dá)，表明在結(jié)腸癌細(xì)胞系中沒有HH通路普遍激活[10]。這表明HH通路所激活的一些靶基因可能同樣被其他通路所調(diào)控。最近的研究表明，TGF-β通路可以調(diào)控Gli的功能[11]，也就是說存在由TGF-β通路調(diào)控的HH信號傳導(dǎo)通路的非經(jīng)典調(diào)控途徑。為了證明在白血病中同樣存在由TGF-β通路介導(dǎo)的HH通路的調(diào)控，筆者進(jìn)行了目前的研究。

本研究選取的KG-1細(xì)胞株屬于急性髓系白血病細(xì)胞，有研究表明在這種白血病細(xì)胞上存在HH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Ptch和Smo分子的缺失，而Gli則有表達(dá)[12]。對于這類細(xì)胞傳統(tǒng)的阻斷HH通路的做法將不起作用，但是因?yàn)榇嬖贕li的表達(dá)，因此，阻斷Gli的表達(dá)將可能成為治療急性白血病的方法之一。對于阻斷Gli的表達(dá)，特異性的siRNA可以起作用，但是對于白血病細(xì)胞，siRNA干擾往往比較困難。本研究應(yīng)用TGF-β1成功地減少了KG-1細(xì)胞Gli1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，1～10 ng/mL TGF-β1作用于KG-1細(xì)胞后的24 h內(nèi)，Gli1的表達(dá)較對照組明顯減少，且較少程度隨作用時間的延長而顯著，但是1 ng/mL TGF-β1組和10 ng/mL TGF-β1組之間沒有明顯差異。分析TGF-β1降低KG-1細(xì)胞的Gli1表達(dá)的機(jī)制，TGF-β1下游的信號是Smad2和Smad3。對于成人，Smad3是TGF-β1最主要依賴的下游信號，而Smad2則在胚胎發(fā)育形成時發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。因此，本研究應(yīng)用SIS3[14]，一種特異性的Smad3的阻斷劑，來阻斷TGF-β1的作用并觀察效果，結(jié)果表明SIS3可以有效阻斷TGF-β1引起的Gli1的表達(dá)降低。因?yàn)镵G-1細(xì)胞不表達(dá)Ptch和Smo[12]，這一點(diǎn)在本研究中已經(jīng)驗(yàn)證，所以TGF-β1降低KG-1細(xì)胞Gli1的表達(dá)，是不依賴于Ptch/Smo這一途徑的，而是依賴于Smad3途徑的。

綜上所述，本研究應(yīng)用TGF-β1可以降低KG-1細(xì)胞的Gli1的表達(dá)，其作用機(jī)制不依賴于Ptch/Smo這一途徑的，而是依賴于Smad3途徑的；提示可以應(yīng)用TGF-β1，并通過Smad3途徑調(diào)控Gli1基因，作用于其下游與細(xì)胞增殖分化有關(guān)的基因，進(jìn)而對白血病起到治療的作用。

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