4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物抑制HSV-2感染研究

陳鈺，宋思維，邱敏，吳稚偉

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210093)

人類單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是生殖器皰疹的病原體，其感染人體后易潛伏在骶神經(jīng)根區(qū)，在一定條件下受到激活后，臨床主要表現(xiàn)為生殖器周圍出現(xiàn)疼痛性皰疹，反復(fù)發(fā)作，難以治愈，為感染率最高的性傳播疾病之一。目前研究表明，HSV-2和HIV-1感染具有協(xié)同作用，HSV-2感染引起的開放性損傷和生殖道局部炎癥可使感染HIV-1的危險(xiǎn)性增加，預(yù)防和治療HSV-2的感染非常重要。目前市售治療HSV-2感染的藥物共50多種，主要為核苷類化合物，主要作用于阻斷病毒建立感染后的復(fù)制過程。而預(yù)防性藥物未見于市面，故開發(fā)新的阻斷病毒侵入預(yù)防性藥物變得尤為重要。本研究探索4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物(PSM)［1-2］這一常用阻垢劑的共聚化合物對(duì)HSV-2病毒感染細(xì)胞和小鼠的作用，評(píng)估其在體內(nèi)和體外的抗病毒效果。

1 材料與方法

1． 1 材料

1．1．1 細(xì)胞和病毒 Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞)、293T、HEC-1-A(人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞)均購自ATCC。HSV-2(G)(實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株)由南京大學(xué)李爾廣教授饋贈(zèng)。

1．1．2 動(dòng)物與分組 BALB/c小鼠，雌性，共40只，體重(15±2)g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。隨機(jī)將小鼠平均編入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1．1．3 主要試劑 PSM購自Sigma公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;pGL4質(zhì)粒、Luciferase檢測試劑盒購自Promega公司;HSV-1/2 gD蛋白抗體及β-catenin蛋白抗體購自 Santa Cruz公司;Depo-Provera購自Pfizer公司;熒光二抗購自O(shè)dyssey公司。

1． 2 方法

1．2．1 病毒的增殖和滴定 在293T細(xì)胞中接種約107pfu HSV-2(G)，48 h后轉(zhuǎn)移1 ml上清到另一皿293T細(xì)胞中，重復(fù)3～5次后獲得毒力較高的HSV-2(G)。接種5×104個(gè)·孔－1Vero細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后依次加入50 μl病毒原液及以 培養(yǎng)基 稀 釋至 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7的病毒液，共計(jì) 8 個(gè)濃度梯度，48 h 后在Vero細(xì)胞上觀察空斑數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1．2．2 Vero-ICP10細(xì)胞系的建立 通過 PCR擴(kuò)增HSV-2的ICP10［3］啟動(dòng)子目的基因片段，其中使用的PCR上游引物為5'GGGGTACCGTCGACAGGCTGTAC3'，下游引物為5'CCCAAGCTTGTCGACAGGACAGC3'，測序正確后通過KpnⅠ和HindⅢ雙酶切克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL4-ICP10-Promoter。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，經(jīng)G418篩選并通過有限稀釋法獲得單克隆，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Vero-ICP10-Promoter，按照Luciferase檢測試劑盒說明書操作檢測熒光素酶活性。

1．2．3 細(xì)胞給藥方式 在96孔板中接種單層Vero細(xì)胞或者HEC-1-A細(xì)胞，待細(xì)胞生長到90%以上融合后，分別加入濃度梯度為 60、20、6．67、2．2、0．74、0．25、0．08 μg·ml－1的 PSM 溶液100 μl，在對(duì)照組中加入100 μl DMEM培養(yǎng)基，混勻后均加入50 μl HSV-2(G)(MOI=1)病毒溶液。

1．2．4 In cell western測定gD蛋白表達(dá) 給藥24 h后，移去96孔板中的培養(yǎng)基并用PBS洗滌去除細(xì)胞表面病毒，每孔加入預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min后用0．1%Triton X-100緩沖液對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行穿孔。使用含Odyssey blocking buffer室溫對(duì)細(xì)胞封閉1 h，每孔加入50 μl含 HSV-1/2 gD蛋白抗體［4］及 β-catenin 蛋白抗體(1∶200)的 blocking buffer于室溫靜置2 h后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，每孔再加入稀釋2 000倍的紅外熒光二抗各50 μl，室溫振蕩 1 h后再用 PBST洗液3次，每次5 min，吸干殘余水分后，使用 Odyssey系統(tǒng)進(jìn)行700 nm和800 nm兩個(gè)通道同時(shí)掃描。所得圖像使用Odyssey 2．1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)化處理，計(jì)算其熒光強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)組都設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

1．2．5 HSV-2陰道感染小鼠模型建立 使用Depo-ProveraTM預(yù)處理使小鼠進(jìn)入動(dòng)情周期并對(duì)HSV-2易感。對(duì)照組將10 μl安慰劑(花生油)預(yù)注入小鼠陰道子宮處［5-6］，待其吸收后注入 8 μl的 HSV-2(G)病毒懸液(5×105pfu)。實(shí)驗(yàn)組小鼠使用10 μl濃度為5%的PSM(該共聚物的交聯(lián)濃度)預(yù)注入小鼠陰道子宮處，待其吸收后注入等劑量的HSV-2(G)病毒懸液。觀察對(duì)比兩組14 d內(nèi)感染情況。

1． 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2． 1 構(gòu)建Vero-ICP10-promotor細(xì)胞系

通過PCR成功獲得ICP10-promotor區(qū)DNA，雙酶切后連接至pGL4載體并轉(zhuǎn)化TOPO10感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，并成功通過G418篩選出單克隆細(xì)胞株，經(jīng)Luciferase檢測能夠在激活I(lǐng)CP10-promotor時(shí)表現(xiàn)出一定的熒光強(qiáng)度。構(gòu)建質(zhì)粒流程見圖1。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig 1 The construction of pGL4-ICP10-Promotor

2． 2 PSM對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞ICP10啟動(dòng)子表達(dá)的影響

在96孔板中接種適當(dāng)密度的構(gòu)建成功的Vero-ICP10-promotor細(xì)胞，給藥24 h后測定熒光素酶活性［7］，取3個(gè)復(fù)孔的平均值，與僅加入HSV-2(PSM濃度為0)的熒光強(qiáng)度相對(duì)比，結(jié)果見圖2。ICP10啟動(dòng)子激活程度越高，熒光素酶強(qiáng)度越高，說明HSV-2感染越嚴(yán)重。由圖2可見，PSM給藥濃度為60～2．22 μg·ml－1時(shí)，均能有效抑制 HSV-2 感染，而濃度較低時(shí)對(duì)HSV-2感染失去抑制作用。

圖2 PSM給藥濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度間關(guān)系Fig 2 The relationship between the concentraions of PSM and the relative fluorescence intensity of Luciferase

2． 3 PSM對(duì)HSV-2gD蛋白表達(dá)的影響

在96孔板中接種適當(dāng)密度的HEC-1-A細(xì)胞，給藥后24 h通過In cell western測定病毒gD蛋白(鼠抗，見Odyssey 800 nm通道掃描結(jié)果，熒光呈綠色)和內(nèi)參β-catenin蛋白(兔抗，見Odyssey 700nm通道掃描結(jié)果，熒光呈紅色)的表達(dá)情況(圖3)，通過內(nèi)參校正，比較不同濃度給藥后對(duì)病毒復(fù)制的影響。由圖3可見，在HEC-1-A細(xì)胞中，PSM對(duì)HSV-2感染的抑制作用呈一定劑量依賴性，且當(dāng)PSM濃度為60～0．74 μg·ml－1時(shí)，效果均較顯著，而在濃度較低時(shí)，也具備一定抗病毒作用。

圖3 PSM給藥濃度和gD蛋白表達(dá)間的關(guān)系Fig 3 The relationship between the concentraions of PSM and the expression of HSV-2 gD

2． 4 PSM對(duì)HSV-2感染小鼠的影響

觀察小鼠14 d內(nèi)是否存在發(fā)病癥狀，如陰道口出現(xiàn)顯著紅腫或者死亡等。對(duì)照組20只小鼠從感染第6天開始，共有17只陰道口顯著紅腫，2只死亡，表明HSV-2感染小鼠模型構(gòu)建成功，而實(shí)驗(yàn)組20只小鼠則只有1只陰道口出現(xiàn)顯著紅腫現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠感染率為95%，實(shí)驗(yàn)組為5%，兩組感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．001)，表明PSM對(duì)HSV-2感染小鼠有顯著抑制作用。

3 討 論

Vero細(xì)胞最初起源于非洲綠猴腎，為HSV-2易感細(xì)胞，常用其進(jìn)行病毒滴度測定;HEC-1-A細(xì)胞是人子宮內(nèi)膜細(xì)胞，由于HSV-2感染常位于生殖器部位，而女性的感染常由陰道部位開始，故使用HEC-1-A細(xì)胞對(duì)HSV-2感染內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。

ICP10是核糖核酸轉(zhuǎn)移酶大亞基的啟動(dòng)子，屬于病毒編碼的早期基因，通過和熒光報(bào)告素酶的連接，可以用于檢測病毒的感染。通過Vero-ICP10-Promotor細(xì)胞系的構(gòu)建，能根據(jù)熒光報(bào)告素酶的強(qiáng)度表明在加入HSV-2病毒24 h后ICP10啟動(dòng)子的激活程度，提示HSV-2感染細(xì)胞的能力。gD蛋白是HSV-2包膜糖蛋白中的一種，是病毒穿膜的關(guān)鍵蛋白之一，同時(shí)gD也是主要的抗原物質(zhì)，而In cell western能檢測出gD蛋白的表達(dá)［8-9］，從而進(jìn)行HSV-2感染的定量。這兩個(gè)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PSM具有抗HSV-2的作用，而兩實(shí)驗(yàn)中PSM的抑制效果不同可能是由于細(xì)胞品系不同、敏感性不同而造成的。而通過成功構(gòu)建HSV-2感染小鼠模型，更證實(shí)了PSM在動(dòng)物感染模型也具有抗HSV-2 的作用［10］。

本實(shí)驗(yàn)中PSM能夠有效抑制HSV-2(G)感染Vero細(xì)胞以及HEC-1-A細(xì)胞，其作用強(qiáng)度表現(xiàn)為在一定濃度范圍內(nèi)有效，呈劑量依賴性，而相關(guān)機(jī)制方面的研究還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索。按其化學(xué)結(jié)構(gòu)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道推測，可能是由于其能在細(xì)胞表面形成保護(hù)，從而抑制病毒感染細(xì)胞［11］，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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