聚氧乙烯辛烷基酚制備去細(xì)胞神經(jīng)移植體

張增祥 趙寶輝 任 寶 薛金偉 張 旋 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北 保定 07000)

周圍神經(jīng)損傷后造成的較長節(jié)段缺損的修復(fù)一直是臨床治療中的難題。自體神經(jīng)移植被公認(rèn)為是周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對長距離缺損或神經(jīng)叢的損傷，往往因沒有充足的自體神經(jīng)來源而使治療陷于困境，且切取后有供區(qū)麻木、疤痕、神經(jīng)瘤等并發(fā)癥。同種異體神經(jīng)來源充足，可以方便地選擇與受損神經(jīng)結(jié)構(gòu)相同或相似的神經(jīng)修復(fù)受損神經(jīng)，但免疫排斥反應(yīng)限制了異體神經(jīng)的臨床應(yīng)用。用組織工程方法降低神經(jīng)的免疫原性，構(gòu)建組織工程化神經(jīng)移植體，就可能應(yīng)用同種異體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，將為臨床修復(fù)周圍神經(jīng)缺損開辟一條新的治療途徑。本研究用聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)萃取周圍神經(jīng)以去除雪旺細(xì)胞等抗原成分，為制備具有天然神經(jīng)結(jié)構(gòu)的人類去細(xì)胞組織工程化神經(jīng)移植體提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 動物：健康新西蘭大耳白兔30只(兔齡2～3個月)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。材料：Triton X-100(Sigma公司)，HITACHIH IB-3型真空離子鍍膜儀、HITACHIH S-3500N型掃描電鏡由河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心提供、層黏連蛋白(Laminin)免疫組化染色試劑等由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本和取材 用空氣栓塞法處死白兔后固定于俯臥位，分別自梨狀肌下緣水平以遠(yuǎn)切取10 mm雙側(cè)坐骨神經(jīng)60根。隨機(jī)分為6組，其中A(12 h組)、B(24 h組)、C(48 h組)、D(96 h組)、E(1 w組)用于化學(xué)萃取，F(xiàn)(新鮮神經(jīng))為對照組。

1.2.2 化學(xué)萃取 先在手術(shù)顯微鏡下剪去表面的脂肪組織和部分神經(jīng)外膜，然后置于4℃蒸餾水中靜置6 h，使細(xì)胞和髓鞘在低滲液體中膨脹、細(xì)胞被脹破，使之易于Triton X-100的滲透;再將神經(jīng)放入3%Triton X-100水溶液中分別靜置12 h;置于蒸餾水中振蕩、漂洗6 h，以使溶于水的Triton X-100膜蛋白復(fù)合體充分脫離神經(jīng)干。如此反復(fù)，并且每次更換蒸餾水、Triton X-100水溶液。5組神經(jīng)Triton X-100萃取時間分別為12 h、24 h、48 h、96 h、1 w。

1.2.3 標(biāo)本處理 在新鮮神經(jīng)和萃取后的神經(jīng)中段分別切取2段2 mm神經(jīng)，1段神經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、縱形切片，分別行HE染色，鏡下觀察雪旺細(xì)胞及神經(jīng)結(jié)構(gòu);磷鎢酸蘇木素(PTAH)染色;光鏡下觀察髓鞘;阿爾辛藍(lán)(Alcian blue)染色;光鏡下觀察髓鞘和基底膜;Laminin免疫組化染色;光鏡下觀察基底膜及其主要成分Laminin。對Laminin免疫組化染色切片進(jìn)行圖像采集，并用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對采集的圖像作定量分析，對Laminin抗體陽性部位進(jìn)行灰度測量，計算單位面積平均灰度。另1段神經(jīng)2.5%戊二醛固定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運(yùn)用SPSS10.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般性狀觀察 新鮮神經(jīng)光澤度好，質(zhì)地較硬，有彈性;神經(jīng)萃取過程中可見兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經(jīng)呈淡乳白色，色暗，無光澤，其外徑及長度較新鮮神經(jīng)減小，柔軟，有韌性，適宜顯微操作。

2.2 石蠟切片組織學(xué)觀察

2.2.1 HE染色 新鮮神經(jīng)均可觀察到雪旺細(xì)胞及軸突等結(jié)構(gòu)，雪旺細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核深染，神經(jīng)內(nèi)膜呈管柱狀排列整齊，髓鞘清晰可見(圖1A)。神經(jīng)上的雪旺細(xì)胞隨著處理時間的延長而逐漸減少，分布不規(guī)則。細(xì)胞核著色變淺，神經(jīng)內(nèi)膜與髓鞘的界限不清。萃取96 h時，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)消失，紅染的神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙(圖1B)。

2.2.2 PTAH染色 鏡下可觀察到染成藍(lán)色的神經(jīng)纖維和基底膜，棕紅色的管柱狀髓鞘結(jié)構(gòu)，膠原纖維染成淺紅或不著色。新鮮神經(jīng)可觀察到藍(lán)色顆粒狀的神經(jīng)軸突，棕紅色髓鞘位于軸突周圍，排列規(guī)則(圖1C)。萃取時間為96 h時，去細(xì)胞神經(jīng)顯示神經(jīng)纖維及髓鞘完全消失，僅留下波浪狀的基底膜(圖1D)。至1 w時仍可見藍(lán)染的基底膜，但連續(xù)性欠佳。

圖1 石蠟切片組織學(xué)觀察結(jié)果(×400)

2.2.3 Alcian blue染色 髓鞘粉染，神經(jīng)基底膜呈綠色。新鮮神經(jīng)可見粉染的髓鞘、綠色的基底膜排列整齊，基底膜位于髓鞘的外面(圖1E)。隨著萃取時間的延長，雪旺細(xì)胞、粉染髓鞘逐漸減少，髓鞘與基底膜的界限不清，至96 h時去細(xì)胞神經(jīng)縱切片上髓鞘消失，綠色的基底膜呈柵欄樣排列，膜與膜之間為中空結(jié)構(gòu)的基底膜管(圖1F)。萃取時間為1 w時基底膜排列規(guī)則，鏡下所見與96 h時相仿，基底膜仍清晰完整，但管狀結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，部分?jǐn)嗔选?/p>

2.2.4 Laminin免疫組化染色 基底膜染成棕紅色，細(xì)胞核淡藍(lán)染。新鮮神經(jīng)縱切片上，棕黃染色的神經(jīng)基底膜呈帶狀縱形排列，位于軸突周圍，排列成管狀，并可見藍(lán)染的細(xì)胞核(圖1G);隨著萃取時間的延長，神經(jīng)上細(xì)胞結(jié)構(gòu)、軸突逐漸減少，96 h的標(biāo)本觀察，去細(xì)胞神經(jīng)上細(xì)胞結(jié)構(gòu)、軸突已消失，染成棕黃色的基底膜則被保留，呈管狀縱形排列，膜與膜之間空虛(圖1H)。至1 w時棕紅色基底膜仍清晰，管狀結(jié)構(gòu)欠規(guī)則。

2.3 計算機(jī)圖像分析 對Laminin免疫組化染色的切片進(jìn)行圖像采集，A～F組切片單位面積Laminin平均灰度分別為140.1±3.41;142.1±3.14;142.1±3.14;140.4±4.03;141.7±2.62;142.7±7.24，各組間比較無顯著差異(P=0.751)。

3 討論

神經(jīng)的再生主要取決于神經(jīng)細(xì)胞所處的微環(huán)境，其主要因素是雪旺細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)所含的基底膜;基底膜可以反作用于雪旺細(xì)胞，增強(qiáng)雪旺細(xì)胞遷移和 büngner's帶的形成〔2〕;刺激雪旺細(xì)胞分裂增殖，沒有基底膜，雪旺細(xì)胞雖可分裂增殖，但卻無法分化成髓鞘，二者關(guān)系密切，共同作用，為神經(jīng)再生提供適宜的微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)表明基底膜各成分對雪旺細(xì)胞的貼壁黏附、分裂增殖以及雪旺細(xì)胞的髓鞘化有重要的作用，所有雪旺細(xì)胞均由一層基底膜包裹，這層基底膜形成一個跨越郎飛氏結(jié)的連續(xù)管狀覆蓋。

同種異體神經(jīng)移植的主要問題是免疫排斥反應(yīng)，而移植免疫的核心問題是組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅱ)。周圍神經(jīng)MHC-Ⅱ的表達(dá)產(chǎn)物主要存在于雪旺細(xì)胞膜表面，構(gòu)成了雪旺細(xì)胞的膜抗原，其抗原性最強(qiáng)，是產(chǎn)生移植免疫的主要原因〔3〕。如何成功去除細(xì)胞和髓鞘結(jié)構(gòu)，以減輕移植體的免疫原性，成為構(gòu)建組織工程化神經(jīng)移植體基本問題;能否成功保留雪旺細(xì)胞基底膜及其立體管狀結(jié)構(gòu)，并保留其主要成分層黏連蛋白的活性，以發(fā)揮其促進(jìn)神經(jīng)再生、促進(jìn)雪旺細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化以及基因表達(dá)的調(diào)控重要的作用，是用組織工程學(xué)方法制備神經(jīng)移植體的核心問題。

Sondell等〔4〕曾報道用Triton X-100和脫氧膽酸處理鼠的坐骨神經(jīng)，剩余的主要成分為無損傷的基底膜管，從而達(dá)到化學(xué)萃取的目的。經(jīng)過化學(xué)萃取處理的異體神經(jīng)移植體無明顯抗原性，去細(xì)胞神經(jīng)能夠促進(jìn)和誘導(dǎo)宿主雪旺細(xì)胞向移植段內(nèi)滲透、遷移和增殖〔5〕，有效地促進(jìn)受體的軸突再生，且無明顯排異反應(yīng)。

Triton X-100是一種溫和的非離子型表面活性劑，具有兩親結(jié)構(gòu)，Triton X-100中的疏水端能和膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，溶解于溶液中〔6〕，本實(shí)驗(yàn)采用3%Triton X-100，因?yàn)闈舛葹?.03～5%的水溶液的濁點(diǎn)基本接近，由此可判斷其親水性或疏水性相近似。神經(jīng)在低滲液體中浸泡處理后，神經(jīng)雪旺細(xì)胞、髓鞘及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)被脹破，以利于Triton X-100的浸潤，Triton X-100能徹底破壞生物膜，并且清除磷脂類物質(zhì)，從而使細(xì)胞溶解破壞。而細(xì)胞外基質(zhì)具有不溶性，所以可完整保留。這一點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)中得到充分體現(xiàn)，萃取過程中可發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)兩端及周圍有絮狀物析出，隨著萃取時間的延長，析出絮狀物逐漸減少。萃取后神經(jīng)外徑及長度較新鮮神經(jīng)減小，柔軟，有韌性，適宜顯微操作。雪旺細(xì)胞、軸突、髓鞘被成功去除，保留了雪旺細(xì)胞基底膜。并且各組神經(jīng)層黏連蛋白仍具有其原有活性。用此法制備的神經(jīng)移植體是一種天然立體管狀支架，保存了完整的雪旺細(xì)胞基膜管結(jié)構(gòu)?；す艿闹饕煞质菍羽みB蛋白、纖維黏連蛋白、Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，具有促進(jìn)引導(dǎo)神經(jīng)再生的作用。此種支架對雪旺細(xì)胞的黏附及其成熟和功能表達(dá)又有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)成功地建立了制備周圍神經(jīng)移植體組織工程學(xué)方法。該支架有良好的仿生性，既可直接移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，又可作為雪旺細(xì)胞植入的支架，應(yīng)用前景廣闊。但移植體與受體的生物相容性如何，促進(jìn)神經(jīng)再生的效果如何，怎樣保存與保存時限如何確定，能否在移植體內(nèi)植入雪旺細(xì)胞等，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。

1 Fawcett JW，Keynes RJ.Muscle basal lamin：a new graft material for peripheral nerve repair〔J〕.J Neurosurg，1986;65(3)：354-63.

2 Milner R，Wilky M，Nishimura S，et al.Division of labor of cells in engrains during migration on peripheral nerve extracellular matrix ligands〔J〕.Dev Biol，1997;185(2)：215.

3 Trumble TE，Shon FG.The physiology of nerve transplantation〔J〕.Hand Clin，2001;16(1)：105-22.

4 Sondell M，Lundborg G，Kanjie M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction〔J〕.Brain Research，1998;795(1)：44-54.

5 Dument CE，Hentz VR.Enhancement of axon growth by detergent extracted nerve grafts〔J〕.Transplantation，1997;63(9)：1210-5.

6 鐘靜芬.表面活性劑在藥學(xué)中的應(yīng)用〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：13-37.