高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(9AA)中抗氧劑的含量

闞微娜，王滬凱

(1．遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110023;2．沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(9AA)中抗氧劑的含量

闞微娜1，王滬凱2

(1．遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110023;2．沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(9AA)中抗氧劑焦亞硫酸鈉與L-鹽酸半胱氨酸含量的方法。方法 采用HPLC法測(cè)定。強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱(磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)，以0．04 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相，柱溫為50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，測(cè)定焦亞硫酸鈉的含量;采用C18柱，以二硫代二丙酸為氧化劑，異硫氰酸苯酯柱前衍生化，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，測(cè)定L-鹽酸半胱氨酸的含量。結(jié)果 焦亞硫酸鈉和L-鹽酸半胱氨酸分別在0．04～0．36和4．24～38．12 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率分別為98．6%和99．6%，RSD分別為0．90%和1．5%(n=9)。結(jié)論 建立了準(zhǔn)確高效的焦亞硫酸鈉與L-鹽酸半胱氨酸的HPLC測(cè)定方法，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

復(fù)方氨基酸注射液;焦亞硫酸鈉;L-鹽酸半胱氨酸;高效液相色譜法;抗氧劑

復(fù)方氨基酸注射液(9AA)系由L-組氨酸、L-蘇氨酸等9種氨基酸加輔料配置而成的滅菌水溶液。由于產(chǎn)品中含有易被氧化的氨基酸如色氨酸，因此抗氧劑在質(zhì)量保證方面擔(dān)負(fù)著極其重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，抗氧劑是影響產(chǎn)品顏色的最顯著的因素［1］，目前生產(chǎn)該品種的企業(yè)普遍采用焦亞硫酸鈉與L-鹽酸半胱氨酸協(xié)同作為抗氧劑使用?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［2］中，并未對(duì)抗氧劑的含量進(jìn)行控制。輸液中的亞硫酸鹽對(duì)機(jī)體有一定毒性［3］，而且另一種抗氧劑L-鹽酸半胱氨酸對(duì)用比色法測(cè)定焦亞硫酸鈉含量存在一定的干擾［4］。此外，L-鹽酸半胱氨酸處方量低(0．01%)，在空氣中不穩(wěn)定，常用的氨基酸分析方法測(cè)定其含量較為困難。本文研究采用高效液相色譜法(HPLC)分別測(cè)定焦亞硫酸鈉與L-鹽酸半胱氨酸的含量，為氨基酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)，為生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量?jī)?nèi)控提供方法。

1 儀器與試藥

島津2010高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、LC-solution工作站。

焦亞硫酸鈉(分析純)、L-鹽酸半胱氨酸(批號(hào)07K8421，純度:≥98%)對(duì)照品，Sigma公司;氨基酸原料(組氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、醋酸賴氨酸及L-鹽酸半胱氨酸)，由遼寧某企業(yè)提供;復(fù)方氨基酸注射液(9AA)，湖北某公司(批號(hào):101203)和某研發(fā)單位中試樣品(批號(hào):20110601，20110602，20110603);二硫代二丙酸及硼酸鹽緩沖液，美國(guó)安捷倫公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 焦亞硫酸鈉

2．1．1 色譜條件 色譜柱:SHODEX Sugar SH1011(200 mm ×8 mm，6 μm)，填充劑為磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基共聚物陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(H+)，以0．04 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相，柱溫為50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm。

2．1．2 溶液的配制 取供試品1 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

取焦亞硫酸鈉約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。本液臨用新配，并密閉保存。

按照處方量稱取9種氨基酸及L-鹽酸半胱氨酸原料，配制成輔料溶液。

2．1．3 測(cè)定方法 分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀。記錄色譜圖(圖1)，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中焦亞硫酸鈉的含量。

圖1 焦亞硫酸鈉對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)和輔料溶液(C)HPLC色譜圖

2．1．4 線性關(guān)系試驗(yàn) 取焦亞硫酸鈉適量，精密稱定，加水制成含焦亞硫酸鈉 0．04，0．12，0．20，0．28和0．36 mg/mL 的溶液，按2．1．3 項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)，濃度(X)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:Y=16 744 X －197，r=0．999 5，在0．04～0．36 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．1．5 定量限測(cè)定 取濃度為0．04 mg/L溶液加水稀釋1 000倍，制成含焦亞硫酸鈉0．04 μg/mL的溶液，按2．1．3項(xiàng)下方法測(cè)定，信噪比為10，方法定量限為 0．04 μg/mL。

2．1．6 精密度試驗(yàn) 取0．20 mg/mL焦亞硫酸鈉溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為1．1%(n=5)，方法精密度良好。

2．1．7 回收率試驗(yàn) 按照處方比例稱取焦亞硫酸鈉及其他成分原料，用水溶解，分別配制成相當(dāng)于供試品濃度80%，100%及120%的溶液各3份，作為回收率樣品溶液，按2．1．3項(xiàng)下方法測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為98．6%，RSD(n=9)為 0．90%。

2．1．8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取0．20 mg/mL焦亞硫酸鈉對(duì)照品溶液，分別于0，2，4h進(jìn)樣，對(duì)照品溶液在4 h內(nèi)不穩(wěn)定，因此對(duì)照品溶液應(yīng)臨用新配。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

取樣品原液，混勻，室溫放置2 h，分別于0，2，4，6 h進(jìn)樣，RSD為1．2%，溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．1．9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，分別制備供試品溶液6份，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，含量的RSD為1．2%(n=6)。

2．1．10 樣品測(cè)定 按2．1．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2．1．3項(xiàng)下方法測(cè)定，4批樣品中焦亞硫酸鈉的濃度均為0．9 mg/mL。

2．2 L-鹽酸半胱氨酸

2．2．1 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5C18(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相 A 相為 0．1 mol/L 醋酸鈉溶液(pH 6．5)-乙腈(93∶7)，B 相為乙腈-水(4∶1)，流動(dòng)相梯度見(jiàn)表2，柱溫為36℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

表2 L-鹽酸半胱氨酸含量測(cè)定流動(dòng)相梯度表

2．2．2 溶液的配制 取供試品1 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

取L-鹽酸半胱氨酸約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，取1 mL，加水稀釋至5 mL，作為對(duì)照品溶液。

按照處方量稱取9種氨基酸原料及焦亞硫酸鈉，配制成輔料溶液。

2．2．3 測(cè)定法 取對(duì)照品(供試品)溶液0．5 mL，加入二硫代二丙酸0．5 mL，80℃水浴反應(yīng)30 min，放冷，取0．5 mL，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液0．25 mL，0．2 mol/L 異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液 0．25 mL，搖勻，室溫放置1 h。按2．2．1 項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖(圖2)，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。

圖2 L-鹽酸半胱氨酸對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)和輔料溶液(C)HPLC色譜圖

2．2．4 線性關(guān)系試驗(yàn) 取L-鹽酸半胱氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成含L-鹽酸半胱氨酸4．24，12．71，21．18，29．65 和 38．12 mg/L 的溶液，按2．2．3項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)，濃度(X)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:Y=5 460 366 X － 6 570，r=0．998 8，在 4．24 ～ 38．12 mg/L的范圍內(nèi)方法線性關(guān)系良好。

2．2．5 定量限測(cè)定 取0．04 mg/L L-鹽酸半胱氨酸溶液，按2．2．3中方法測(cè)定，信噪比為10，方法定量限為0．04 mg/L。

2．2．6 精密度試驗(yàn) 取21．18 mg/L L-鹽酸半胱氨酸溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為0．9%(n=5)，方法精密度良好。

2．2．7 回收率試驗(yàn) 按照處方比例稱取L-鹽酸半胱氨酸原料及其他成分原料，用水溶解，分別配制成相當(dāng)于供試品濃度80%，100%及120%的溶液各3份，作為回收率樣品溶液，按2．2．3中方法測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。平均回收率為98．6%，RSD(n=9)為 0．90%。

2．2．8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品原液，按2．2．2項(xiàng)制成供試品溶液，按2．2．3項(xiàng)方法測(cè)定，分別于0，2，4，6 h 進(jìn)樣測(cè)定，峰面積 RSD 為 0．7%(n=4)，溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．2．9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，分別制備供試品溶液6份，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，含量的 RSD為0．86%(n=6)。

表3 L-鹽酸半胱氨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

2．2．10 樣品測(cè)定 按2．2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2．2．3項(xiàng)方法測(cè)定，并計(jì)算L-鹽酸半胱氨酸的含量，結(jié)果三批中試樣品的含量(相對(duì)于標(biāo)示量的百分含量)依次為 101．3%，107．1%及 95．4%，市售樣品為90．8%。

3 討論

文獻(xiàn)［4］介紹的氧化還原比色法操作復(fù)雜，結(jié)果準(zhǔn)確度低，L-鹽酸半胱氨酸作為較強(qiáng)的還原劑，也對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定的影響。HPLC法能夠高效快速的測(cè)出焦亞硫酸鈉的含量，而且準(zhǔn)確度高，其它輔料對(duì)測(cè)定不存在干擾。

在與其它氨基酸共存的條件下，含硫氨基酸的定量較為困難，尤其是L-鹽酸半胱氨酸在空氣中極其不穩(wěn)定，更為定量帶來(lái)了一定難度。處方中L-鹽酸半胱氨酸作為組合使用的抗氧劑，強(qiáng)還原劑焦亞硫酸鈉及其它氨基酸的存在，更為L(zhǎng)-鹽酸半胱氨酸的定量帶來(lái)了一定的難度。目前測(cè)定L-鹽酸半胱氨酸多使用過(guò)甲酸將其氧化成穩(wěn)定的化合物后，再使用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定，而很多生產(chǎn)企業(yè)并沒(méi)有配備氨基酸分析儀這類大型且用途專一的分析儀器，為企業(yè)質(zhì)控帶來(lái)了一定的難度［5］。

本文采用二硫代二丙酸為氧化劑，將L-鹽酸半胱氨酸氧化成為穩(wěn)定的化合物，再使用異硫氰酸苯酯法柱前衍生化，用HPLC法測(cè)定，得到了較好的測(cè)定L-鹽酸半胱氨酸的方法，為生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)控提供依據(jù)。

［1］ 鄒瑩瑩，楊士友，田 軍．抗氧劑在藥物制劑方面的應(yīng)用［J］．安徽醫(yī)藥，2008，12(11):1096-1098．

［2］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］．二部第六冊(cè)(生化第一分冊(cè))．1989:79-80．

［3］ 胡容融．氨基酸輸液中抗氧劑亞硫酸鹽的控制與測(cè)定［J］．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，17(4):283-284．

［4］ 吳小曼，紀(jì) 宇．比色法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(18AA-Ⅰ)中焦亞硫酸鈉的含量［J］．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8(5):38-40．

［5］ 紀(jì) 宇．比色法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液(18AA-Ⅲ)中的半胱氨酸［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2006，27(6):367-368．

Determination of antioxidants in Compound Amino Acids Injection(9AA)by HPLC

KAN Wei-na1，WANG Hu-kai2
(1．Liaoning Institute for Food and Drug Control，Shenyang 110023，China;2．Shenyang Seventh People's Hospital，Shenyang 110003，China)

Purpose To establish HPLC methods for the determination of antioxidant sodium pyrosulfite and L-cysteine hydrochloride monohydrate in Compound Amino Acids Injections(9AA)．Methods The MKF-CIS chromatograph column was used with the mobile phase of 0．04 mol/L H3PO4．The detection wavelength was 200 nm to determine the content of the sodium pyrosulfite．A C18column was used for HPLC method with PITC precolumn derivation，DTDPA as oxidant agent and determing L-cysteine hydrochloride monohydrate at 254 nm．Results The calibration curves of the two components were 0．04-0．36 mg/mL(sodium pyrosulfite)and 4．24-38．12 mg/L(cysteine)respectively．Their recoveries were 98．6%and 99．6%，with RSD of 0．90%and 1．5%(n=9)，respectively．Conclusion The methods can accurately and efficiently determine sodium pyrosulfite and cysteine so as to improve the quality of injection．

Compound Amino Acids Injections;sodium pyrosulfite;L-cysteine hydrochloride monohydrate;HPLC;antioxidant

R927．1

A

1005-1678(2012)06-0833-04

2012-07-12

闞微娜，女，碩士研究生，主管藥師，研究方向:生化藥物分析，Tel:024-25425029，E-mail:kanweina@126．com。