酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量

朱昱寧，敖 雷，傅應華

(1．平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 平湖 314200;2．嘉興學院 醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001)

酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量

朱昱寧1，敖 雷2，傅應華2

(1．平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 平湖 314200;2．嘉興學院 醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001)

目的 建立酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素含量的方法。方法 采用硫酸軟骨素ABC酶制備樣品，高效液相色譜法測定含量。以Ultimate XB-NH2柱(4．6 mm×25 cm，5 μm)分離樣品，醋酸鈉緩沖液(pH 5．6)-乙腈(950∶50)為流動相，流速1．0 mL/min，檢測波長232 nm，進樣量10 μL，柱溫30℃。結(jié)果 在此色譜條件下，硫酸軟骨素A、B、C三組分分離良好;硫酸軟骨素濃度在300～3 000 μg/mL之間與峰面積呈良好線性關系;高、中、低三個濃度平均加樣回收率為102．1%，100．4%和97．5%。結(jié)論 本法簡便、準確、可靠，可用于硫酸軟骨素的含量測定。

硫酸軟骨素;酶解法;高效液相色譜法;含量測定

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是一種從豬、牛、魚等動物軟骨組織中提取制得的天然大分子酸性黏多糖類藥物，為中國藥典2010年版二部收載品種［1］。CS常見的有三種構(gòu)型:CS A、CS C和 CS B，其化學結(jié)構(gòu)通式為由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖所組成的重復二糖結(jié)構(gòu)以糖苷鍵首尾相連形成的多糖鏈，其中CS A在N-乙酰氨基半乳糖的C4位常帶有硫酸酯基，分子質(zhì)量約為50 000;CS C在N-乙酰氨基半乳糖的C6位常帶有硫酸酯基，分子質(zhì)量在3 000～50 000之間;CS B在N-乙酰氨基半乳糖的C4和C6位上均無硫酸酯基。CS是以CS A和CS C為主的混合物。在哺乳類動物(豬、牛、雞等)軟骨組織中約含70%CS A和30%CS C;在鯊魚軟骨中含90%CS C和10%CS A。CS具有預防和治療視力和聽力下降以及降血脂、抗血栓、抗炎癥、抗病毒及抗腫瘤和抑制腫瘤新生血管生成等多種作用，已廣泛應用于食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。

CS的含量測定方法主要有電位滴定法［2-4］、咔唑法［5］、高效液相色譜法［6-9］、高效毛細管電泳法［10］和酶解高效液相色譜法［1，11-12］。文獻報道的酶解高效液相色譜法主要為陰離子交換色譜法。本文采用CS ABC酶酶解法制備樣品，研究并建立了CS A、CS B和CS C三組分在氨基柱上的分離條件及定量測定方法。

1 儀器與藥品

美國Dionex高效液相色譜儀由P680四元低壓梯度泵、UVD170U紫外-可見檢測器、ASI-100自動進樣器、Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站組成。

牛軟骨CS對照品，含量99．9%以上，美國USP對照品;CS ABC酶，10 U/瓶，美國 Sigma公司;CS樣品，牛軟骨提取，嘉興恒杰生物工程有限公司生產(chǎn)，批號:100818，100912，100922;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與色譜圖

色譜柱:Ultimate XB-NH2柱(5 μm，4．6 mm ×25 cm);流動相:醋酸鈉緩沖液(稱取無水醋酸鈉3．9 g和無水硫酸鈉 6．8 g，加水 1 000 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié) pH 至 5．6)-乙腈(950∶50);流速:1．0 mL/min;檢測波長:232 nm;進樣量:10 μL;柱溫:30℃。色譜圖見圖1。

2．2 溶液的制備

2．2．1 三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液 稱取Tris 6．0 g，無水乙酸鈉 8．0 g，加水 900 mL，用冰乙酸調(diào)pH 至8．0，再加水至1 000mL。

2．2．2 CS ABC酶解液 取 CS ABC酶1瓶(10 U)，加入Tris緩沖液5 mL，溶解，置－20℃保存。

2．3 測定法

取經(jīng)105℃干燥4 h的CS對照品約20 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入Tris緩沖液25 mL，CS ABC酶解液200 μL，混勻，置37℃恒溫水浴中反應3 h(不時振搖使溶液溫度均勻)。取出，置100℃水浴加熱3 min，終止反應，放冷，加水至刻度，搖勻，15 000 r/min離心15 min，取上清液再用0．45 μm濾膜濾過，取濾液作為對照品溶液。另取供試品約20 mg，精密稱定，同制備對照品溶液的方法操作，制得供試品溶液。取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算供試品中CS A、CS B、CS C三組分的含量總和。

2．4 進樣精密度

取對照品溶液，重復進樣6次，測定CS A、CS B和CS C三組分的峰面積，計算三組分峰面積總和的RSD 為1．36%。

2．5 重復性試驗

取批號為100818供試品約20 mg，精密稱定，共6份，按2．3項下方法操作，測得6份樣品含量分別為 90．87%，91．23%，91．45%，91．08%，91．96%和92．34%，平均 91．5%，RSD 為 0．61%。重復性良好。

2．6 線性關系考察

精密稱取CS對照品100 mg，置10 mL量瓶中，加Tris緩沖液溶解并稀至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，再分別精密量取 0．3，0．5，1．0，2．0 和 3．0 mL，置10 mL量瓶中，各加Tris緩沖液至8 mL，再分別加入CS ABC酶解液300 μL，按2．3項下方法操作，制備系列梯度對照品液，各進樣10 μL測定CS A、CS B、CS C三組分峰面積，以三組分峰面積之和(Y)為縱坐標，CS濃度(X，μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為:Y=0．028 8 X+0．075 2，r=1．000。表明 CS濃度在300 ～3 000 μg/mL 之間呈良好的線性關系。

2．7 溶液穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，在室溫放置 0，2，4，8，12，24 h，取樣測定，得6次測定的三組分峰面積之和的RSD為2．12%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2．8 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品約11 mg，精密稱定，共6份，置25 mL量瓶中，各精密加入CS對照品溶液(10 mg/mL)0．8，1．0，1．2 mL，再加入 Tris 緩沖液19 mL，溶解，按2．3項下方法操作制得供試品溶液，分別進樣測定，另取對照品溶液同法測定，按外標法以峰面積計算CS A、CS B、CS C三組分含量總和，得高、中、低3個濃度平均加樣回收率分別為102．1%，100．4% 和 97．5%;RSD 為 1．37%，1．47%和1．79%(n=3)。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2．9 樣品測定

取3批樣品各約20 mg，精密稱定，按2．3項下方法制備供試品溶液，進樣測定，另取對照品溶液同法測定，按外標法以峰面積計算 CS A、CS B、CS C三組分含量總和，結(jié)果3批樣品(批號:100818，100912和 100922)的 CS含量分別為 91．5%，92．4%和90．8%;RSD(n=3)分別為 1．5%，1．7%和 0．9%。

3 討論

3．1 測定波長的選擇

取CS二糖鈉鹽CS A、CS B、CS C對照品適量，用流動相制成一定濃度，于200～400 nm范圍掃描，結(jié)果在232 nm波長處有最大吸收，故選擇232 nm作為測定波長。

3．2 色譜條件的選擇

由于CS經(jīng)CS ABC酶酶解反應產(chǎn)生的二糖結(jié)構(gòu)CS A、CS B、CS C均含有-COOH和-OH基團，為聚陰離子化合物，是一種強極性物質(zhì)，在反相C18色譜柱上保留時間短，不能將CS A、CS B、CS C三組分很好分離。文獻報道采用強陰離子交換色譜柱分離樣品，能夠較好地將這三種組分分離，但流動相需要梯度洗脫，分析周期長，約需45 min。經(jīng)試驗采用極性氨基柱，恒流洗脫，這三種組分能夠得到良好分離，并考察了流動相中醋酸鈉與硫酸鈉濃度對三組份保留時間的影響。結(jié)果表明，提高硫酸鈉濃度，能增加這三種組分的保留時間，改善分離，但硫酸鈉濃度太高，會使三組分峰形變差，確定每1 000 mL中含硫酸鈉6．8 g為宜;提高醋酸鈉濃度對三組分分離影響不大?？疾炝鲃酉鄍H的影響，采用醋酸鹽緩沖液，在不同pH值條件下檢測三組份的分離度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)控制流動相pH值以5．6為佳。同時考察乙腈比例的影響，結(jié)果表明增加乙腈比例，對三組分分離度影響不大，以1 000 mL中含乙腈50 mL為宜。在此色譜條件下，測定一次約需10 min，達到快速分析的目的。

3．3 酶解條件的選擇

為了提高含量測定數(shù)據(jù)準確性，增大樣品取用量，實際測定時稱取樣品20 mg，置25 mL量瓶中，加Tris緩沖液20 mL使溶解，目的是使CS ABC酶在pH 8．0介質(zhì)中保持一個高活性狀態(tài)，根據(jù)稱樣量及酶活性加入過量的 CS ABC酶解液200 μL，CS ABC酶解液反應最適宜溫度為37℃［1］，反應3 h含量達到最大值，故取反應時間為3 h。為了減少樣品溶液中的蛋白質(zhì)對色譜柱造成損害，在進樣前先將樣品液在100℃加熱3 min使其凝固，經(jīng)離心除去雜質(zhì)，再經(jīng)0．45 μm濾膜濾過，可得澄清的供試品溶液。

通過酶解法將CS分解產(chǎn)生3個二糖鈉鹽結(jié)構(gòu)的化合物，采用CS對照品同法測定作對照，同時測定三組分含量，提高了定性定量的準確性，為CS多組分定量測定提供了方法依據(jù)。

［1］ 中國藥典［S］．二部．2010:984-986．

［2］ USP［S］．2009:980-982．

［3］ EP［S］．2008:1525-1527．

［4］ BP［S］．2010:489-492．

［5］ 傅應華．咔唑法測定鯊魚硫酸軟骨素含量的方法學研究［J］．中國生化藥物雜志，2007，38(1):54-55．

［6］ 曾 芬．RP-HPLC法測定鯊魚康膠囊中硫酸軟骨素含量［J］．海峽藥學，2010，22(7):88-90．

［7］ 趙振鋒，段 鋼．高效液相色譜方法中不同色譜柱測定硫酸軟骨素的比較［J］．中國生化藥物雜志，2007，28(3):203-204．

［8］ 潘自強，陶禮萍，李愛珍，等．硫酸軟骨素的 RP-HPLC測定［J］．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38(9):659-661．

［9］ 石瑞平，胡海勛．離子對反相高效液相色譜法測定硫酸軟骨素滴眼液的含量及有關物質(zhì)［J］．藥物分析雜志，2008，28(9):1574-1577．

［10］沈建如，陳振德，于榮敏．高效毛細管電泳法測定硫酸軟骨素含量［J］．中國生化藥物雜志，2010，31(3):197-199．

［11］王 偉，王 虎，易 瓊．酶解液相色譜法檢測硫酸軟骨素含量及物種來源鑒定［J］．檢驗檢疫學刊，2010，20(6):19-20．

［12］于海洲，范慧紅，宋玉娟，等．硫酸軟骨素含量測定方法研究進展［J］．中國生化藥物雜志，2011，32(2):160-162．

Determination of chondroitin sulfate content by enzymatic HPLC

ZHU Yu-ning1，AO Lei2，F(xiàn)U Ying-hua2
(1．The No．1 People's Hospital of Pinghu，Pinghu 314200，China;2．Medical School of Jiaxing University，Jiaxing 314001，China)

Purpose To establish an enzymatic HPLC method for determination of chondroitin sulfate content．Methods The sample was prepared by chondroitinase ABC and the content was determined by HPLC．The sample was separated and analyzed on a Ultimate XB-NH2column(25 cm ×4．6 mm，5 μm)，and a salt acetate buffer solution(pH 5．6)-acetonitrile(950∶50)was used as mobile phase．The flow rate was 1．0 mL/min．The detective wavelength was 232 nm．The injection volume was 10 μL．The column temperature was 30 ℃．Results The chondroitin sulfate A，B，C three ingredient peaks could be separated each other completely．The calibration curve was linear at a range of 300-3 000 μg/mL．The average recoveries(n=3)of high，middle，low concentrations were 102．1%，100．4%and 97．5%respectively．Conclusion The method was simple，accurate，reliable．It can be used for the determination of content in chondroitin sulfate．

chondroitin sulfate;enzymatic method;HPLC;determination

R927．2

A

1005-1678(2012)06-0827-03

2012-07-18

朱昱寧，男，藥師，E-mail:zhuyuning@qq．com;傅應華，女，通信作者，副教授，主要從事藥物制劑與質(zhì)量標準研究工作，Tel:0573-83643848，E-mail:yaoji6217@sohu．com。