小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育過(guò)程中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1表達(dá)的變化

陳 冬，宮 亮，李 里

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 1．耳鼻咽喉科，2．兒科，遼寧 錦州 121001)

小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育過(guò)程中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1表達(dá)的變化

陳 冬1，宮 亮1，李 里2

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 1．耳鼻咽喉科，2．兒科，遼寧 錦州 121001)

目的 觀(guān)察胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)在小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)和分布特點(diǎn)，探討其生物學(xué)特性及意義。方法 制作耳蝸組織切片，采用多重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)染色方法，激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察小鼠出生后12 d的IGF-1在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的分布和定位。應(yīng)用Western blot及Real-time PCR法檢測(cè)新生小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)在出生后不同時(shí)期IGF-1蛋白及IGF-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 IGF-1在小鼠耳蝸發(fā)育期中在螺旋神經(jīng)節(jié)均有表達(dá)，表達(dá)在整個(gè)細(xì)胞體上。小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的IGF-1蛋白及IGF-1 mRNA表達(dá)水平隨著出生年齡增加而逐漸減少。結(jié)論 IGF-1在小鼠耳蝸發(fā)育期中在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)均有表達(dá)。表達(dá)量隨著出生年齡增加而逐漸減少。推測(cè)其可能通過(guò)旁分泌和自分泌方式在局部發(fā)揮其功能，在內(nèi)耳細(xì)胞增殖中可能起重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子;毛細(xì)胞;耳蝸

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是內(nèi)耳的生長(zhǎng)發(fā)育的重要神經(jīng)因子［1］，在耳蝸生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)節(jié)組織器官內(nèi)細(xì)胞間的協(xié)調(diào)穩(wěn)定有重要作用。IGF-1對(duì)動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)感覺(jué)上皮和神經(jīng)元的發(fā)育、分化及存活可能有一定的調(diào)節(jié)作用［2］，但其在耳蝸發(fā)育中的變化以及對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的保護(hù)作用及機(jī)制都不十分清楚。本研究對(duì)正常生長(zhǎng)發(fā)育的小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)進(jìn)行IGF-1的表達(dá)和定位分布特點(diǎn)的檢測(cè)，并探討其生物學(xué)特性及意義。

1 材料

Trizol(美國(guó) Invitrogene公司 );小鼠抗 IGF-1抗體、神經(jīng)絲蛋白抗體(neurofilament)(美國(guó)Santa Cruz公司);FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG，Cy5標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG(美國(guó)Jackson公司);RT-PCR試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)。

Access RT PCR系統(tǒng)(Promega公司);激光共聚焦顯微鏡(Zeiss 510M，Germany)。

SPF級(jí)新生昆明小鼠購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(遼)2011-00070。

2 方法

2．1 多重?zé)晒鈽?biāo)記免疫組織化學(xué)染色法觀(guān)察IGF-1在耳蝸的表達(dá)

取出生后0和12 d的新生昆明小鼠，每組8只(16耳)，制作蝸軸組織切片，滴加一抗:適當(dāng)比例稀釋的 IGF-1(1∶500)及神經(jīng)絲蛋白抗體(1∶100)，4 ℃過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液沖洗，5 min×3次。然后滴加熒光分子標(biāo)記的混合二抗:即以1∶50稀釋的FITC和Cy5標(biāo)記的IgG，兩者以1∶1的比例混合。然后在室溫下中孵育40 min，甘油封片。以相應(yīng)波長(zhǎng)激光激發(fā)后(FITC為514 nm，Cy5為610 nm)在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察IGF-1在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的分布和定位。

2．2 Western blot檢測(cè)蝸軸組織IGF-1蛋白表達(dá)

取出生后0，4，12，20 d的新生昆明小鼠，每組16只(32耳)，提取小鼠耳蝸蝸軸組織蛋白。采用Western blot技術(shù)檢測(cè)蝸軸螺旋神經(jīng)節(jié)IGF-1蛋白。采用HPlsA 1000圖文分析系統(tǒng)分析膠片，用IGF-1的灰度值表示IGF-1的相對(duì)表達(dá)水平。

2．3 RT-PCR檢測(cè)蝸軸組織IGF-1 mRNA表達(dá)

取出生后0，4，12，20 d的新生昆明小鼠，每組16只(32耳)，參照Trizol說(shuō)明書(shū)，提取小鼠蝸軸組織總RNA。采用Access RT PCR系統(tǒng)將提取的總RNA一步法擴(kuò)增成DNA目的片段。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，49℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。4℃保存。IGF-1引物序列:上游引物為 5'GCTGAGCTGGTGGACGCTCTAG 3';下游引物為5'AATGTTTACTTGTGTATTTCATTG 3';目的片段為217 bp;內(nèi)參照β-actin上游引物為5'CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3';下游引物為5'ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3';目的片段為194 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后紫外分析儀觀(guān)察、照相，并用HPlSA 1000圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，用IGF-1與β-actin的灰度比值表示IGF-1的相對(duì)表達(dá)水平。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件包組間差異比較用單因素方差分析F檢驗(yàn)，兩組間差異比較用q檢驗(yàn)(LSD法)，均以P＜0．05(雙側(cè)檢驗(yàn))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 IGF-1小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)表達(dá)

經(jīng)一抗、二抗孵育后，用激光共聚焦顯微鏡514 nm激發(fā)顯色，IGF-1抗體結(jié)合部位發(fā)出綠色熒光。激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察蝸軸切片標(biāo)本，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中存在IGF-1表達(dá)，主要位于胞漿，分布不均勻。IGF-1免疫陽(yáng)性染色反應(yīng)也可見(jiàn)于小鼠耳蝸切片中的螺旋神經(jīng)節(jié)。圖1為出生12 d小鼠耳蝸切片中耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中IGF-1的表達(dá)情況，綠色熒光顯示FITC標(biāo)記的IGF-1，藍(lán)色熒光顯示Cy5標(biāo)記的神經(jīng)絲蛋白(neurofilament)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡熒光多重標(biāo)記法觀(guān)察IGF-1

3．2 IGF-1蛋白及mRNA在小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)

IGF-1蛋白在各組小鼠的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)組織中的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2。IGF-1 mRNA在各組小鼠的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)組織中的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1。IGF-1蛋白及mRNA表達(dá)水平隨著出生年齡增加而逐漸減少，0 d時(shí)與4，12，20 d時(shí)比較，IGF-1蛋白及 mRNA的表達(dá)水平均有顯著差異(P＜0．01)，4 d時(shí)與12，20 d時(shí)比較，IGF-1蛋白及mRNA的表達(dá)水平也均有顯著差異(P＜0．01)，而12 d時(shí)與20 d時(shí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

圖2 IGF-1蛋白在新生小鼠各組的蝸軸組織中的表達(dá)

4 討論

IGF-1是一種結(jié)構(gòu)和功能都與胰島素類(lèi)似的多肽類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子?？梢栽谌砀魈幈磉_(dá)，在正常成熟腦組織中有著十分廣泛的低水平表達(dá)。神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有IGF-1表達(dá)。它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。對(duì)維持成年腦的正常功能起到重要作用，它可抑制細(xì)胞凋亡，有助于細(xì)胞受損后的功能恢復(fù)［3-5］。

表1 IGF-1 mRNA在新生小鼠各組的蝸軸組織中的表達(dá)(n=32，x±s)

本研究經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察熒光免疫細(xì)胞化學(xué)以及Western blot等多種方法證明了IGF-1在小鼠耳蝸發(fā)育期中在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)。IGF-1表達(dá)量隨著出生年齡增加而逐漸減少。推測(cè)其可能通過(guò)旁分泌和自分泌方式在局部發(fā)揮其功能，調(diào)控小鼠耳蝸的生長(zhǎng)發(fā)育。隨著耳蝸發(fā)育的逐漸成熟其發(fā)育調(diào)控下調(diào)，表達(dá)逐漸減少。

IGF-1作為一種非選擇性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，可作用于中樞神經(jīng)發(fā)育成熟的全過(guò)程，促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞增生、分化、營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)功能的維持調(diào)節(jié)［6］。體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示鼠成神經(jīng)細(xì)胞在IGF-1培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的數(shù)量是普通培養(yǎng)液中的8～40倍。在缺血缺氧大鼠的動(dòng)物模型中，檢測(cè)腦組織的IGF-1 mRNA，顯示損傷后第3天在受累腦組織區(qū)域可見(jiàn)IGF-1 mRNA的表達(dá)增加。

IGF-1目前在臨床上主要應(yīng)用于糖尿病、周?chē)窠?jīng)病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，IGF-1將是一種極有前途的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療藥物。有研究表明，重組人IGF-1應(yīng)用生物可降解水凝膠可以有效防護(hù)噪聲所致聽(tīng)力下降［7-8］，但目前IGF-1在耳聾保護(hù)的應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

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The expression of Insulin-like Growth Factor-1 in the spiral ganglion cells of normal developing mice

CHEN Dong1，GONG Liang1，LI Li2
(1．ENT Department，2．Pediatric Department，The No．1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Purpose To study the expression and distribution of Insulin-like Growth Factor(IGF-1)in the spiral ganglion cells of the normal developing mice，and to elucidate the function and biological characteristics of IGF-1．Methods The expression and distribution of IGF-1 of the spiral ganglion cells during normal developing mice was observed by multiplicitas fluorescence immunohistochemistry with laser scanning confocal microscope．IGF-1 protein and m RNA was examed by Western blot and RT-PCR．Results In the spiral ganglion cells of cochlea，multifluorescence immunohistochemically showed that IGF-1 was widely distributed in the cell body of the spiral ganglion cells．The protein and mRNA expression of IGF-1 in the spiral ganglion cells and the quantity of expression decreased with aging．Conclusion There was expressions of IGF-1 in the spiral ganglion cells in normal developing mice．The expressions are related to ages，when the age increased，the expressions will decrease．IGF-1 may play an important role in signal transduction during inner ear cell proliferation as a paracrine and autocrine manner．

Insulin-like Growth Factor;spiral ganglion cells;cochlea

R963

A

1005-1678(2012)06-0789-03

2012-08-22

遼寧省教育廳高等學(xué)校科研項(xiàng)目(2009A460)

陳 冬，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事耳鼻咽喉科相關(guān)疾病的基礎(chǔ)研究和臨床工作，E-mail:entdoctorchen@163．com。