柱前衍生化HPLC法測(cè)定黃河灘棗多糖的單糖組成

郝蕾蕾，張典瑞，趙忠熙，劉 燕

(山東大學(xué) 藥學(xué)院，藥物制劑與釋藥系統(tǒng)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

柱前衍生化HPLC法測(cè)定黃河灘棗多糖的單糖組成

郝蕾蕾，張典瑞，趙忠熙，劉 燕

(山東大學(xué) 藥學(xué)院，藥物制劑與釋藥系統(tǒng)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

目的 建立PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化HPLC法測(cè)定黃河灘棗多糖的單糖組成。方法 采用水提醇沉法提取黃河灘棗多糖，多糖水解后進(jìn)行PMP衍生化，HPLC法測(cè)定黃河灘棗多糖的單糖組成及摩爾比，并對(duì)等度和梯度洗脫兩種模式的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果 黃河灘棗多糖由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等六種單糖組成，它們的摩爾比約為 0.54∶0.50∶0.27∶2.03∶5.40∶1.00，等度和梯度洗脫測(cè)定結(jié)果基本一致。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的等度洗脫方式更加簡(jiǎn)便易行，快速準(zhǔn)確，適用于黃河灘棗多糖的單糖組成分析。

黃河灘棗多糖;單糖組成;PMP柱前衍生;高效液相色譜

黃河灘棗(以下簡(jiǎn)稱“大棗”)，是黃河流域兩岸地帶培育的大紅棗，含有多糖、黃酮、皂苷、三萜、生物堿、環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷等多種生物活性物質(zhì)［1］。大棗多糖是其中最重要的活性成分之一，可作為免疫促進(jìn)劑，能控制細(xì)胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與衰老，有效清除人體內(nèi)的氧自由基，是抗衰老的主要活性成分。近年來的研究進(jìn)一步證實(shí)，大棗多糖具有抗癌、治療肝損傷、抗艾滋病、抗病毒等生理功能，并對(duì)放射性損傷有一定的保護(hù)作用［2-4］。

大棗由于產(chǎn)地、采摘時(shí)期的不同，都可能造成單糖的組分有差別，研究和改進(jìn)單糖組分的測(cè)定方法對(duì)于深入開發(fā)大棗多糖很有必要。柱前衍生化HPLC法是目前分離和檢測(cè)多糖中單糖組成較常用的方法，PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)作為還原性糖的最好衍生化試劑之一，在堿性條件下能與單糖定量縮合生成單糖-PMP衍生物，該衍生物不易裂解及產(chǎn)生異構(gòu)峰并在250 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收［5］。本文采用PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定黃河灘棗多糖的單糖組成及摩爾比，并對(duì)等度和梯度洗脫兩種方式測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，以探索更加準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單易行且重現(xiàn)性好的單糖組分分析方法。

1 材料

黃河灘棗(大棗)，產(chǎn)自陜西榆林佳縣，洗凈，45℃烘干，適度粉碎后備用。

PMP(99.0%)、D-甘露糖(Man，≥99.0%)、L-鼠李糖(Rha，≥99.0%)、D-半乳糖醛酸(GalUA，≥97.0%)、D-葡萄糖 (Glc，≥99.5%)、D-半乳糖(Gal，≥99.0%)、L-阿拉伯糖(Ara，≥99.0%)等均購于美國(guó)Sigma公司;乙腈為色譜純;苯酚、氯仿等試劑均為分析純。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，包括G1311B型四元泵、G1367E型高性能自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B型DAD檢測(cè)器等;UV-2102PCS型紫外可見分光光度儀(上海龍尼柯儀器有限公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(菏澤市鑫源儀器儀表有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗多糖的提取

采用水提醇沉法［6-8］提取大棗多糖:取去核棗粉50.0 g，加入 80% 乙醇 250 mL，回流脫脂兩次，過濾，取棗渣加入10倍量的水，90℃水浴浸提3次，離心分離合并多糖提取液;將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后緩慢加入無水乙醇，至溶液中乙醇濃度為80%時(shí)，收集多糖沉淀，用丙酮洗滌數(shù)次，再以水溶解沉淀，得到粗多糖溶液;用氯仿-正丁醇脫蛋白，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.8，加入多糖溶液體積40%的H2O2，40℃水浴保溫4 h脫色;脫色液對(duì)水透析24 h，無水乙醇沉淀，離心分離，45℃真空干燥，即得大棗多糖。

2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定大棗多糖的糖含量

分別取100 μg/mL Glc 溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，依次加水使最終體積為 1 mL。另取水1 mL作空白對(duì)照，每支試管加5%苯酚溶液1.6 mL，再加入硫酸7 mL，搖勻放置冷卻至室溫。在491 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:A=0.008 2 C+0.017 0，r=0.998 9。取一定量的大棗多糖樣品液進(jìn)行測(cè)定，得大棗多糖的糖含量為42.58%，可進(jìn)一步水解來分析大棗多糖的單糖組成。

2.3 大棗多糖的水解

準(zhǔn)確稱取精制大棗多糖30.0 mg，于安瓿中加入2 mol/L硫酸，用氮?dú)馀疟M空氣，封管后于110℃烘箱中水解8 h，得大棗多糖水解樣品液。冷卻至室溫，NaOH 溶液中和至 pH 7.0，0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液用于PMP衍生化。

2.4 單糖對(duì)照品的柱前衍生［9-10］

分別準(zhǔn)確稱取 Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara各1 mmol，分別溶于0.3 mol/L NaOH 溶液10 mL中，得到6種單糖的對(duì)照溶液，低溫密封保存。各取相同體積的6種單糖對(duì)照溶液混勻，得到混合對(duì)照單糖溶液。分別取6種單糖溶液、混合溶液各100 μL與 0.5 mol/L PMP的甲醇溶液100μL混合，70℃水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液100μL進(jìn)行中和，再加入水1 mL及氯仿1 mL進(jìn)行萃取，充分振蕩離心，吸棄下層有機(jī)相，重復(fù)3次，合并上層水相，水相溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用水稀釋至一定濃度用于HPLC分析。

2.5 大棗多糖水解液的柱前衍生

將大棗多糖水解樣品液用0.3 mol/L NaOH溶液稀釋一定濃度后，按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，HPLC進(jìn)樣分析。

2.6 色譜條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm ×100 mm，2.7 μm);流動(dòng)相:0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)-乙腈;等度洗脫時(shí)，緩沖液與乙腈體積比為82∶18;梯度洗脫時(shí)，時(shí)間從 0→10→20 min，對(duì)應(yīng)的乙腈體積分?jǐn)?shù)0→18%→25%;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。

2.7 柱前衍生化方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系和最小檢測(cè)限考察 配制6種單糖對(duì)照品一系列摩爾濃度的NaOH溶液，按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，得到單糖衍生物濃度為0.05～5.0 mmol/L的溶液，按等度洗脫依次進(jìn)樣10μL，根據(jù)測(cè)得的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)單糖的濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性回歸。再將最小摩爾濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣，計(jì)算當(dāng)信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)溶液的質(zhì)量濃度以確定最低檢測(cè)限(LOD)，結(jié)果如表1所示。

2.7.2 進(jìn)樣精密度和方法重復(fù)性考察 6種單糖衍生物的溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣分析7次，Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara的儀器精密度(RSD，n=7)分別為 0.63%，0.90%，1.50%，1.72%，1.81%，1.82%。

同一批對(duì)照品平行配制3份混合溶液進(jìn)行衍生處理，每一個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，得到3個(gè)平行樣中Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara 的方法精密度(RSD，n=3)分別為 0.83%，0.47%，0.69%，1.04%，0.94%，1.07%。

可見，進(jìn)樣精密度和方法重復(fù)性的峰面積RSD均小于2.0%，因此PMP柱前衍生化HPLC法適用于簡(jiǎn)單含糖樣品中單糖組成的分析。

2.7.3 回收率考察 精密吸取已知單糖含量的大棗多糖水解液6份，加入等量的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，HPLC等度洗脫測(cè)定峰面積，代入單糖的回歸方程，計(jì)算回收率。得Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara 的回收率分別為98.5%，100.2%，103.2%，96.7%，97.4% 和98.6%;RSD 分別為 1.02%，0.94%，1.61%，1.19%，1.29%和 1.32%。

2.7.4 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性考察 將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，從氯仿萃取后開始計(jì)時(shí)，于 2，4，6，8，10，12 和 24 h 分別連續(xù)進(jìn)樣 3次，HPLC等度洗脫進(jìn)行分析。12 h內(nèi) Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara的衍生物峰面積的 RSD為1.12%，1.06%，1.37%，1.21%，1.58% 和 1.53%。但在24 h測(cè)定時(shí)所有衍生物峰面積下降較多，各峰面積減小幅度在8.0% ～12.0%之間。所以要想獲得精確的結(jié)果，最好在12 h內(nèi)分析。

表1 6種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Calibration curves of six monosaccharides

2.8 大棗多糖中的單糖組成分析

2.8.1 大棗多糖的PMP衍生化HPLC分析(等度洗脫) 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖及大棗多糖水解衍生液的等度洗脫色譜圖如圖1所示。由圖可見，大棗多糖的單糖組成包括 Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara 等 6種單糖，在12 min內(nèi)均達(dá)到基線分離，按文獻(xiàn)方法［11］計(jì)算得到的單糖摩爾比為 0.54∶0.50∶0.27∶2.03∶5.40∶1.00。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖(A)及大棗多糖水解衍生液(B)的色譜分離圖(等度洗脫)Fig.1 HPLC separation of standard monosaccharides(A)and the derivatives of jujube polysaccharide hydrolysates(B)(isocratic elution)

2.8.2 大棗多糖的PMP衍生化HPLC分析(梯度洗脫) 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖及大棗多糖水解衍生液的梯度洗脫色譜圖如圖2所示。由圖可見，大棗多糖的單糖組成包括 Man、Rha、GalUA、Glc、Gal和 Ara 等 6種單糖，在18 min內(nèi)均達(dá)到基線分離，按文獻(xiàn)方法［11］計(jì)算得到的單糖摩爾比為 0.53∶0.50∶0.27∶2.01∶5.36∶1.00。

兩種洗脫方式測(cè)定結(jié)果基本一致。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖(A)及大棗多糖水解衍生液(B)的色譜分離圖(梯度洗脫)Fig.2 HPLC separation of standard monosaccharides(A)and the derivatives of jujube polysaccharide hydrolysates(B)(gradient elution)

3 討論

本文直接將單糖樣品溶于NaOH溶液，衍生之前按照一定的配比移取一定量的糖的NaOH溶液進(jìn)行衍生，簡(jiǎn)化了操作步驟。但是糖的NaOH溶液如在常溫下放置，隔夜后衍生產(chǎn)物峰面積會(huì)有變小趨勢(shì)，有時(shí)會(huì)有雜峰出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ara的NaOH溶液常溫放置24 h后，衍生產(chǎn)物峰面積減小并且在保留時(shí)間6.8 min左右出現(xiàn)一個(gè)雜峰，可能是糖的醛基在堿性條件下容易氧化而導(dǎo)致了異構(gòu)反應(yīng)的發(fā)生，而在低溫4℃保存3 d后峰面積依然沒有明顯改變且未見雜峰出現(xiàn)。所以該糖的NaOH溶液要低溫密閉保存。

本實(shí)驗(yàn)將大棗多糖水解液用NaOH溶液中和(pH約為7.0)后直接進(jìn)行PMP衍生化，由于PMP殘留試劑出峰時(shí)間明顯超前于單糖衍生物，因此省去了多糖水解樣品及其衍生化產(chǎn)物的干燥過程，衍生化后的溶液用氯仿萃取后即可直接進(jìn)樣分析，對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，從而簡(jiǎn)化了操作步驟。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，以等度與梯度洗脫兩種方式對(duì)大棗多糖的單糖組分及摩爾比進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)等度洗脫模式進(jìn)行了方法學(xué)考察。兩種洗脫方式測(cè)定結(jié)果基本一致，但改進(jìn)后的等度洗脫方法更加簡(jiǎn)便易行，短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到單糖組分的有效分離，為大棗多糖及各種多糖類物質(zhì)的組分分析提供了一個(gè)新途徑。

［1］原 超，范三紅，林勤保.紅棗的功效成分［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010(9):12-13.

［2］Wang B.Chemical characterization and Ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(3):386-391.

［3］Li JW，Shan L，Liu Y F，et al.Screening of a functional polysaccharide from Zizyphus Jujuba cv.Jinsixiaozao and its property［J］.Int JBiol Macromol，2011，49(3):255-259.

［4］羅 莉，玉崧成，王金水.大棗多糖結(jié)構(gòu)及藥理活性的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(30):16860-16861.

［5］吳建元，肖玉玲，孫曼春，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析茯苓多糖的單糖組成［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(9):1213-1214.

［6］蔣水星，陳雪峰，趙天殊.響應(yīng)面法優(yōu)化大棗多糖的提取工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):3652-3654.

［7］李 培，楊 潔，朱敖蘭，等.若羌紅棗多糖提取方法的研究［J］.生物技術(shù)，2008，18(1):70-73.

［8］吳海玥.紅棗多糖沉淀特性及脫蛋白質(zhì)工藝研究［J］.食品與藥品，2008，10(3):21-23.

［9］林 雪，賈敬芬，黃琳娟，等.RP-HPLC用于蘆薈多糖的單糖組成研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(4):192-195.

［10］姚瑞祺，劉海英，牛鵬飛，等.超聲輔助提取大棗多糖及柱前衍生高效液相分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(12):162-166.

［11］馬定遠(yuǎn)，陳 君，李 萍，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成［J］.分析化學(xué)，2002，30(6):702-705.

Determination of monosaccharide components of Huanghe jujube polysaccharides by pre-column derivatization HPLC method

HAO Lei-lei，ZHANG Dian-rui，ZHAO Zhong-xi，LIU Yan
(School of Pharmaceutical Sciences and Center for Pharmaceutical Research ＆ Drug Delivery Systems，Shandong University，Jinan 250012，China)

Purpose To establish PMP pre-column derivatization HPLC method for determination of monosaccharide components of Huanghe jujube polysaccharides.Methods The polysaccharides of Huanghe jujube were extracted with water，precipitated by ethanol and then the monosaccharides were derivated with PMPafter hydrolyzed.HPLC method was used to study the monosaccharide components and molar ratio of Huanghe jujube polysaccharides，and the two patterns of isocratic elution and gradient elution were compared and analyzed.Results Huanghe jujube polysaccharides were composed of D-mannose，L-rhamnose，D-galacturonic acid，D-glucose，D-galactose，and L-arabinose and their molar ratio was about 0.54∶0.50∶0.27∶2.03∶5.40∶1.00，with almost the same results of isocratic elution and gradient elution.Conclusion The isocratic elution method used in this experiment is more simple，quick and accurate and can be used to analyze the monosaccharide components of Huanghe jujube polysaccharides.

Huanghe jujube polysaccharides;monosaccharide compositions;PMPpre-column derivatization;HPLC

R284

A

1005-1678(2012)06-0740-04

2011-12-22

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào):2012CB126315)

郝蕾蕾，女，碩士研究生，Tel:0531-88380293;張典瑞，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:0531-88382015，E-mail:zhangdianrui2006@163.com。