紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位

李嘉瑋，劉曉穎，王振英

（a.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；b.天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位

李嘉瑋，劉曉穎，王振英

（a.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；b.天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

利用生物信息學(xué)方法對(duì)紫花苜蓿MsDREB1進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.結(jié)果表明，該序列含有AP2典型結(jié)構(gòu)域，在N端存在核定位信號(hào).為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因功能，構(gòu)建MsDREB1與綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因融合的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－MsDREB1，再利用基因槍將其轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦掃描顯微鏡下觀察MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位.結(jié)果表明，MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核中，符合DREB家族轉(zhuǎn)錄因子特性.

紫花苜蓿；MsDREB1基因；GFP表達(dá)載體；亞細(xì)胞定位

植物中存在許多轉(zhuǎn)錄因子，而脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子（Dehydration responsive element binding，DREB）在抵抗低溫、高鹽和干旱脅迫中發(fā)揮重要作用.典型的轉(zhuǎn)錄因子功能結(jié)構(gòu)域包括以下4個(gè)部分：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域、寡聚化位點(diǎn)和核定位信號(hào).其中核定位信號(hào)（Nuclear localization signal，NLS）是一段富含精氨酸殘基的核定位區(qū)域，是保證轉(zhuǎn)錄因子順利進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)控作用的重要區(qū)段［1－3］.目前已經(jīng)在擬南芥、棉花、大豆、油菜等多種植物中證實(shí)DREB基因中核定位信號(hào)的存在.牛一丁等［4］在紫花苜蓿中克隆了MsDREB1，劉曉穎等［5］對(duì)低溫處理后紫花苜蓿MsDREB1表達(dá)情況進(jìn)行了研究分析，但對(duì)MsDREB1的核定位信息以及產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位尚缺乏詳細(xì)研究.該研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)MsDREB1的NLS進(jìn)行分析，并且構(gòu)建該基因與綠色熒光蛋白基因融合的植物表達(dá)載體，利用基因槍轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，觀察在活細(xì)胞狀態(tài)下MsDREB1－GFP融合蛋白在細(xì)胞中的分布和定位，對(duì)MsDREB1的核定位信號(hào)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步的基因功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和主要試劑

將紫花苜蓿種子消毒，點(diǎn)種于培養(yǎng)土（草碳土的體積分?jǐn)?shù)為50%，蛭石的體積分?jǐn)?shù)為25%，珍珠巖的體積分?jǐn)?shù)為25%）中，置于培養(yǎng)室，生長(zhǎng)溫度23℃ ，光照／黑暗＝16h／8h，培養(yǎng)20d后，4℃低溫處理2h備用.

質(zhì)粒pCAMBIA1302、大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存.抗生素購(gòu)自上海生工公司，引物的合成及DNA序列測(cè)定均由華大基因公司完成.各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RNAiso Plus試劑盒均為寶生物（大連）工程有限公司產(chǎn)品.凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司.

1.2 第一鏈cDNA的合成

按RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書的步驟提取紫花苜蓿葉片的總RNA，經(jīng)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）1.0%瓊脂糖凝膠電泳和A260／A280比值鑒定RNA的質(zhì)量，－80℃保存?zhèn)溆?利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為：總 RNA 2μg，Oligod（T）18（10 μmol／L）5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5×AMV Buffer 4μL，RNase inhibitor 0.5μL，AMV 2μL，補(bǔ)充DEPC水至20μL.將上述溶液混勻后，26℃ 保持10min，42℃ 保持60min，冰浴2 min.

1.3 MsDREB1基因的克隆及序列分析

根據(jù)紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子MsDREB1（GenBank No.EU233782）的cDNA 序列，以及 pCAMBIA1302載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物：MsDREB1－F：5’－CATGCCATGGTAATGATTAATACCA－3（斜體下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）；MsDREB1－R：5’－GGACTAGTAAAGTTCCATAGTGATA－3’（斜體下劃線部分為SpeⅠ酶切位點(diǎn)）.PCR擴(kuò)增體系以cDNA為模板，F(xiàn)、R引物各100ng，200μmol／L dNTPs，2.5UTaq酶，總體系50μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min.經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段回收、克隆、測(cè)序.

測(cè)序結(jié)果在NCBI／GenBank／Blast進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)在http：／／cubic.bioc.columbia.edu／predictNLS對(duì)核定位區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè).

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

利用NcoⅠ／SpeⅠ分別雙酶切pGEM－T－Ms－DREB1和質(zhì)粒載體pCAMBIA1302質(zhì)粒，將目的片段與表達(dá)載體分別回收，用T4連接酶連接，獲融合表達(dá)載體pCAMBIA1302－MsDREB1.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，以卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，然后對(duì)其進(jìn)行PCR（引物為MsDREB1－F及MsDREB1－R）和雙酶切（NcoⅠ／SpeⅠ）鑒定，選取陽(yáng)性克隆子，用于重組質(zhì)粒的擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒，－80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.5 重組質(zhì)粒pCAMBIA1302－MsDREB1轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞

切取約2cm×2cm的洋蔥表皮組織置于固體1／2MS平板培養(yǎng)基上，28℃弱光下預(yù)培養(yǎng)12h.將構(gòu)建好的表達(dá)載體pCAMBIA1302－MsDREB1包裹金粉，在無(wú)菌條件下，利用基因槍（Bio－rad，PDS1000）轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，具體方法參照儀器使用說(shuō)明.轉(zhuǎn)化后材料置28℃弱光下培養(yǎng)12h，同時(shí)轉(zhuǎn)化pCAMBIA1302空載體作為陰性對(duì)照.

1.6 MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位觀察

將培養(yǎng)后的洋蔥表皮制片，利用共聚焦掃描顯微鏡（NIKON ECLIPSE 90i）在488nm波長(zhǎng)激發(fā)下，觀察MsDREB1－GFP融合蛋白在細(xì)胞中的分布和定位，同時(shí)拍攝明場(chǎng)圖像作為對(duì)照.

2 結(jié)果與分析

2.1 MsDREB1基因的克隆及序列分析

以含有MsDREB1的全長(zhǎng)序列的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期目標(biāo)基因大小一致的片段，見圖1.

圖1 MsDREB1PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of MsDREB1

用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段，并連接到pGEM－T easy vector上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM－T－MsDREB1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，陽(yáng)性克隆測(cè)序后，目的片段全長(zhǎng)為651bp.在NCBI／GenBank／Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與牛一丁等［4］報(bào)道的MsDREB1序列一致.將得到的核苷酸序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列，在http：／／cubic.bioc.columbia.edu／predictNLS上進(jìn)行核定位信號(hào)分析后發(fā)現(xiàn)，在第37～52氨基酸位置存在可能的核定位信號(hào)PKKRAGRKIFKETRHP.

2.2 紫花苜蓿MsDREB1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將質(zhì)粒 pGEM－T－MsDREB1經(jīng)NcoⅠ／SpeⅠ雙酶切后，獲得目的基因，將目的基因插入同樣經(jīng)NcoⅠ／SpeⅠ雙酶切的pCAMBIA1302載體中，并對(duì)獲得的重組質(zhì)粒pCAMBIA1302－MsDREB1進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定（圖2），PCR產(chǎn)物以及雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，均有一約650bp的片段，與插入的目的基因大小一致，證明載體構(gòu)建成功.

圖2 質(zhì)粒經(jīng)NcoI和SpeI雙酶切及PCR驗(yàn)證電泳結(jié)果Fig.2 Results of plasmids digestion and PCR

2.3 MsDREB1基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位

利用基因槍轟擊洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞后，使用共聚焦顯微鏡在488nm波長(zhǎng)下觀察GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達(dá)情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照載體在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有具體的定位，綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞；而轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞核內(nèi)，綠色熒光強(qiáng)度明顯高于陰性對(duì)照組，表明MsDREB1編碼的蛋白已定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明MsDREB1具有DREB轉(zhuǎn)錄因子家族共有的核定位特性（圖3）.

圖3 MsDREB1－GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的核定位Fig.3 Nuclear localization of the MsDREB1－GFP fusion protein in onion skin cells

3 討論

DREB類轉(zhuǎn)錄因子作為干旱、低溫和高鹽等非生物逆境脅迫的主要應(yīng)答因子，在植物抗逆性綜合改良方面起著重要作用.DREB隸屬于AP2／EREBP家族，它含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與DRE／CRT順式作用元件結(jié)合，調(diào)控大量非生物脅迫相關(guān)基因表達(dá)，例如rd29A、cor15A、Kin1等［6－7］.這些產(chǎn)物的綜合作用可以提高植物對(duì)干旱、低溫、高鹽的抗逆性［1］.DREB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合下游目的基因的DRE（dehydration responsive element）順式作用元件，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，在下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)生，因此DREB蛋白必定有一個(gè)核定位區(qū)域，將該蛋白定位至細(xì)胞核內(nèi)用來(lái)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用.

通過(guò)對(duì)MsDREB1基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，在http：／／cubic.bioc.columbia.edu／predictNLS上可以預(yù)測(cè)編碼蛋白的核定位信號(hào)NLS在其AP2結(jié)構(gòu)域上游，具有一定的保守性.該研究根據(jù)載體設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，將目的基因插入到pCAMBIA1302的35S啟動(dòng)子和報(bào)告基因GFP之間，同時(shí)保證GFP的編碼區(qū)不發(fā)生移位，以此構(gòu)建出能夠在植物體內(nèi)表達(dá)MsDREB1－GFP融合蛋白的重組載體.利用基因槍將重組質(zhì)粒導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，對(duì)MsDREB1－GFP融合蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，成功地將該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中，由圖3C、D可以看出該蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中大量存在，這一結(jié)果與Agarwal等［2］所報(bào)道的DREB轉(zhuǎn)錄因子特性一致.由此可以推斷MsDREB1基因編碼的蛋白在胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，與DRE順式作用元件結(jié)合，啟動(dòng)一系列功能基因的表達(dá).該研究中成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－Ms－DREB1，可通過(guò)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染擬南芥等，將MsDREB1－GFP融合蛋白轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，為該基因在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上抗逆作物轉(zhuǎn)基因研究打下基礎(chǔ).

［1］ LIU Q，ZHAO N M，YAMAGUCH－SHINOZAKI K，et al.Regulatory role of DREB transcription factors in plant drought，salt and cold tolerance［J］.Chinese Science Bulletin，2000，6：970－975.

［2］ AGARWAL P K，AGARWAL P，REDDY M K，et al.Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress toler－ance in plants［J］.Plant Cell Rep，2006，25：1263－1274.

［3］ IMAGAWA M，SAKAUE R，TANABE A，et al.Two nuclear localization signals are required for nuclear transcription of nuclear factor 1－A［J］.FEBS Lett，2000，484（2）：118－124.

［4］ 牛一丁，哈斯阿古拉，張麗，等.紫花苜蓿逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MsDREB1基因克隆與分析［J］.植物生理學(xué)通訊，2008，6：454－458.

［5］ 劉曉穎，潘麗娜，李嘉瑋，等.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)紫花苜蓿DREB基因的方法［J］.天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，30（4）：68－70.

［6］ LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP／AP2DNA－binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low－temperature－responsive gene expression in Arabidopsis［J］.Plant Cell，1998，10：1391－1406.

［7］ SAKUMA Y，MARUYAMA K，OSAKABE Y，et al.Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor，DREB2 A，involved in drought－responsive gene expression［J］.Plant Cell，2006，18：1292－1309.

Subcellular localization ofMsDREB1gene in alfalfa

LIJia－wei，LIUXiao－ying，WANGZhen－ying
（a.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；
b.Tianjin Key Laboratory of Cyto－Genetical and Molecular Regulation，Tianjin 300387，China）

Bioinformatics analysis shows thatMsDREB1gene in alfalfa contains AP2／EREBP DNA domain，and has nuclear localization signal in the N－terminal.In order to further verify the function of this gene，aplant expression vector pCAMBIA1302－－MsDREB1with a green fluorescent protein （GFP）gene has been constructed and then transformed into onion skin cells by gene gun method.The result of transient expression which was showed in the confocal scanning microscope indicated that theMsDREB1gene products was located in the nucleus which is in line with the characteristics of DREB transcription factor family.

alfalfa（MedicagosativaL.）；MsDREB1gene；GFP plant expression vector；subcellular localization

Q78

A

1671－1114（2012）01－0085－03

2011－05－30

天津市科委重點(diǎn)資助項(xiàng)目（11ZCKFNC00700）；天津師范大學(xué)市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金資助項(xiàng)目，天津師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室改革研究基金資助項(xiàng)目（B200912）

李嘉瑋（1986—），女，碩士研究生.

王振英（1966—），女，教授，博士，主要從事植物抗性分子生物學(xué)方面的研究.

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）