阪崎腸桿菌3種檢測方法的應用與分析

牛振東，劉文杰，孫偉，高春

（北京市藥品檢驗所，北京 100035）

阪崎腸桿菌3種檢測方法的應用與分析

牛振東，劉文杰，孫偉，高春

（北京市藥品檢驗所，北京 100035）

分別采用美國FDA、ISO/TS 22964-2006和GB4789-2010阪崎腸桿菌檢測方法，同時采用緩沖液蛋白胨水（BPW）作為前增菌液，對FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）提供嬰幼兒配方奶粉進行阪崎腸桿菌定性檢測，同時應用VITEK2生化鑒定和16SrDNA序列分析技術(shù)對分離的可疑菌落進行確認。結(jié)果表明：mLST-Vm選擇性增菌肉湯和DFI顯色平板可以提高工作效率和陽性檢出率，可疑菌落易于識別，VITEK2（全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)）和16SrDNA測序技術(shù)應用可以實現(xiàn)阪崎腸桿菌高效、快捷的檢測。

嬰兒配方奶粉；阪崎腸桿菌；FAPAS

0 引 言

阪崎腸桿菌（Enteribacter Sakazakii），又名黃色陰溝腸桿菌，為腸桿菌科腸桿菌屬的一個種，革蘭氏陰性桿菌，有周鞭毛，能運動，無芽孢，氧化酶實驗陰性。1980年建議將該菌作為腸桿菌科的一新種，并改名為阪崎腸桿菌[1，10]，2008年阪崎腸桿菌被重新分類一個新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）,包括5個新種和3個亞種[13-14]。 阪崎腸桿菌（Enteribacter Sakazakii）是嬰兒配方奶粉中重要的污染源，可導致嬰兒腦膜炎和小腸結(jié)腸炎等疾病，其發(fā)病率高達80%[2,9]，阪崎腸桿菌與沙門氏菌列為嬰兒配方奶粉的A類致病菌[3]。

現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展為阪崎腸桿菌檢測提供了便利，Mohan等人根據(jù)阪崎腸桿菌外膜蛋白A（om-pA）基因設(shè)計引物，建立PCR檢測方法[11]。本研究應用VITEK2生化鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列分析技術(shù)[16]可以實現(xiàn)阪崎腸桿菌的準確鑒定。

1 實 驗

1.1 樣品來源

2011年3月份參加FAPAS能力驗證樣品（嬰兒配方奶粉），樣品A和樣品B。

1.2 培養(yǎng)基、試劑和儀器

培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST broth），腸道桿菌增菌肉湯（EE broth），結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA），胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA），萬古霉素（Vancomycin，Vm），緩沖蛋白凍水溶液（BPW），阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI瓊脂）。試劑：Platinum PCR SuperMix，DL 2000 Marker，GoldView。

儀器：全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2）（bio Merieux）

1.3 方法

1.3.1 樣品前增菌：

無菌取檢樣10 g加入已預熱至44℃裝有90 mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，緩慢搖動至充分溶解，37℃±1℃培養(yǎng)18～22 h。

1.3.2 FDA阪崎腸桿菌檢測方法[4]

移取上述增菌液10 mL轉(zhuǎn)種到裝有90 mL無菌EE肉湯的三角燒瓶中，36℃孵育過夜。充分混合每個瓶中的增菌培養(yǎng)液，每份增菌液用直徑3 mm（10 μL）的接種環(huán)分別分區(qū)劃線接種2個VRBGA平板和2個顯色培養(yǎng)基平板，將平板置36℃±1℃培養(yǎng)18～22 h。挑取VRBGA平板上的粉紫色疑似菌落劃線接種TSA平板，25℃ ±1℃培養(yǎng)48～72 h。挑取TSA平板上黃色菌落進行營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)，革蘭染色，做氧化酶試驗。革蘭染色陰性，氧化酶試驗陰性者進行VITEK2 compact（全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)）生化鑒定。

1.3.3 ISO/TS 22964-2006[5]和GB4789-2010阪崎腸桿菌檢測方法[6]

移取1 mL上述增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL的mLST-Vm肉湯，44℃ ±0.5℃培養(yǎng)（24±2）h。輕輕混勻過夜培養(yǎng)的mLST-Vm肉湯，各取增菌液1環(huán)分別劃線接種于2個DFI平板，44℃±1℃培養(yǎng)（24±2）h（ISO/TS 22964-2006），36℃±1℃培養(yǎng)（24±2）h（GB4789-2010）。挑取1～5個藍綠色，直徑為1～3 mm的可疑菌落，劃線接種于TSA平板，25℃培養(yǎng) （48±4）h。自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行氧化酶試驗，氧化酶試驗陰性的菌落進行VITEK2 compact（全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)）生化鑒定。

1.3.4 VITEK2 compact生化鑒定

挑取可疑菌落（TSA平板上的純培養(yǎng)物），進行革蘭氏染色鏡檢及氧化酶實驗，按照VITEK2儀器操作指南配置菌懸液 （革蘭氏陽性菌GP卡和革蘭氏陰性菌GN卡制成0.6～1.0麥氏濃度），選擇相應的卡片上機檢測。

1.3.5 16S rDNA序列分析

基因組DNA提取雙歧桿菌標準菌株和樣品分離得到的中雙歧桿菌的基因組DNA提取方法參照文獻[7]。16SrDNA序列的擴增用上述制備的基因組DNA為16SrDNA PCR擴增的模板。PCR的2個擴增引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）分別位于16S rDNA的8-27和1493-1514位的堿基片段（以E.coli的16S rDNA堿基位置為準）。PCR擴增的片段約為1.5 kb。PCR擴增反映程序：95℃預變性5 min，之后的30個循環(huán)包括95℃ 預變性1 min，55℃“退火”1 min,72℃延伸2min。30個循環(huán)后72℃延伸10min，最后4℃保存?zhèn)溆?。擴增得到的PCR產(chǎn)物直接送到公司測序，測序由英駿生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 樣品檢測結(jié)果

FAPAS提供的樣品A和樣品B，結(jié)果在A樣品中未檢出阪崎腸桿菌，能力驗證提供的干擾菌落為大腸埃希菌，B樣品中檢出阪崎腸桿菌。

2.2 阪崎腸桿菌的菌落形態(tài)

VRBGA平板上呈紫紅色大菌落，周圍有一圈紫色的不透明的膽汁酸沉淀環(huán)，圓形凸起,直徑2～3 mm。DFI平板上呈藍綠色菌落（阪崎腸桿菌具有產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，該培養(yǎng)基中含有5-溴4氯-3-吲哚-α-D葡萄糖苷酶，因此，阪崎腸桿菌在此平板上呈現(xiàn)藍綠色菌落）。阪崎腸桿菌在TSA平板能夠快速生長，隨著培養(yǎng)時間的延長菌落直徑逐漸增大，且呈黃色菌落。菌株均為革蘭陰性桿菌，菌體短桿狀、卵圓形、球桿狀，成對或呈鏈狀排列，無芽胞。

2.3 VITEK2compact生化鑒定

VITEK2（全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)）鑒定結(jié)果，A樣品可疑菌落鑒定為大腸埃希菌，B樣品中的可疑菌落鑒定為阪崎腸桿菌。檢測結(jié)果如表1。

表1 樣品A和B的VITEK2鑒定結(jié)果

2.4 3種標準中鑒定方法比較

參考GB4789.40-2010、FDA和ISO/TS 22964-2006方法對FAPAS提供的樣品進行檢測，并且比較3種檢測方法的優(yōu)越性，不同之處如表2所示。

表23 種檢測方法的比較

2.5 16SrDNA序列分析結(jié)果

分別挑取從樣品A和B中分離得到的純培養(yǎng)物，A樣品和B樣品進行PCR擴增，在1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳檢測圖譜如圖1所示，同時用滅菌水作為空白對照。純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測序儀測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對（GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences），結(jié)果樣品A的16S rDNA序列與大腸埃希菌FUA1242（NCBIAccession HQ169124.1）、FUA1241（NCBI Accession HQ169122.1的16S rDNA序列同源性均達到了99%，可以推斷樣品A屬于阪崎腸桿菌，樣品B的16S rDNA序列與阪崎腸桿 菌fmb01（NCBIAccessionJF330127.1）、G4026（NCBI Accession HQ880305.1）的16S rDNA序列同源性均達到了99%，可以推斷樣品B屬于阪崎腸桿菌。

3 討 論

（1）FDA檢驗方法中使用VRBGA結(jié)晶紫葡萄糖瓊脂平板于分離、鑒定阪崎腸桿菌的培養(yǎng)基,由于腸桿菌科的許多菌屬如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌等腸桿菌均可在VRBGA平板上形成與阪崎腸桿菌相類似的特征性菌落，因此該平板選擇性差,增加了檢測難度，易造成檢出假陽性結(jié)果[8]。阪崎腸桿菌能產(chǎn)生α-D-葡萄糖苷酶，可分解底物5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙產(chǎn)生藍綠色特征性菌落，易于識別，ISO+TS+22964-2006和GB4789.40-2010將選擇性培養(yǎng)基修改為DFI，提高了檢出率，也易于可疑菌落的識別。但是，從表1可以看出，ISO和GB4789的不同點在于選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度不同，ISO采用44℃，GB4789采用的是36℃，兩種培養(yǎng)溫度都能夠達到檢測效果，但是通過實驗發(fā)現(xiàn)，DFI平板在44℃培養(yǎng)時水分蒸發(fā)太大，平板容易干燥，相反，36℃培養(yǎng)時平板的水分蒸發(fā)的速度減慢，平板不容易干燥，這樣就能夠更好的保證檢測結(jié)果。

（2）EE肉湯作為增菌液，由于該肉湯適合所有腸道菌的生長，因此會造成細菌生長的競爭性抑制，不利于目標菌落的篩選，且阪崎腸桿菌可耐受較高的生長溫度和耐高鹽，加入萬古霉素可很好的抑制革蘭陽性菌的生長。ISOISO+TS+22964-2006和GB4789.40-2010將阪崎腸桿菌檢測方法進行了改進，在前增菌的培養(yǎng)基中采用了mLST-Vm，而且培養(yǎng)溫度提高至44°C，這樣就可以有利于阪崎腸桿菌的篩選。

（3）現(xiàn)行的培養(yǎng)法作為細菌檢測鑒定中的標準,在鑒定和檢測過程中起著重要且決定性作用,由于培養(yǎng)時間長，步驟繁瑣成為其的缺點。生化鑒定仍然是目前的主要手段，API20E是國標和FDA標準中規(guī)定的鑒定試驗，API20E在實驗操作[15]，結(jié)果判斷方面仍有很多不便和不足之處，需要在反應孔內(nèi)添加菌懸液，培養(yǎng)24 h，再次添加輔助試劑利用顏色反應對結(jié)果進行判斷，實驗人為因素較大，需要時間長，不利于快速檢測阪崎腸桿菌，因此，本研究采用VITEK2鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定，縮短了檢測時間，完全機器化操作，避免了人為干擾，可以實現(xiàn)快速高通量的鑒定。分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，為進一步研究和探索適合阪崎腸桿菌檢測及鑒定的分子生物學方法提供了技術(shù)支持。目前針對阪崎腸桿菌的分子生物學檢測方法有BAX病原菌檢測系統(tǒng)[12]、Riboprinter全自動微生物分析系統(tǒng)，16 srDNA測序的分子生物學鑒定技術(shù)。本研究中應用16SrDNA序列分析技術(shù)和VITEK2全自動生化鑒定系統(tǒng)對分離的細菌進行了鑒定，這兩項技術(shù)檢測快速，簡便，檢測成本較低，為快速檢測與鑒定阪崎腸桿菌提供了有效的手段，同時可以為其他食源性致病菌的快速檢測提供了技術(shù)支持。

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Analyzing and application three detection methods for Enterobacter sakazakii

NIU Zhen-dong，LIU Wen-jie，SUN Wei，GAO Chun
（Beijing Institute for Drug Control,Beijing 100035，China）

Using the U.S.FDA,ISO/TS 22964-2006 and GB4789-2010 of E.sakazakii detection methods,BPW pre-enrichment broth for detection of E.sakazakii,in FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）providing infant formula Formula，while application of VITEK2 compact system and 16SrDNA sequencing to confirm the perspective colonies.The results showed that mLST-Vm selective enrichment broth and DFI chromogenic panel can improve efficiency and positive rate,easy to identify suspected colonies.，Enterobacter sakazakii were detected rapidly and accurately by VITEK2 compact system and 16SrDNA sequencing.

infant formula;Enterobacter sakazak ii;FAPAS

TS252.7

A

1001-2230（2012）09-0042-04

2012-04-09

牛振東 （1979-），男，主管藥師，從事保健食品、藥品微生物限度檢查。