黑曲霉發(fā)酵液中脂肪酸化學(xué)成分的研究*

王 嬙馮煥鵬劉吳娟李 祝*陳 青

（1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025） （2貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴陽 550025）

黑曲霉發(fā)酵液中脂肪酸化學(xué)成分的研究*

王 嬙1**馮煥鵬2劉吳娟1李 祝1***陳 青2

（1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025） （2貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴陽 550025）

目的：分析黑曲霉（Aspergillus niger xj）發(fā)酵液中的脂肪酸成分。方法：液體發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉（Aspergillus niger xj），發(fā)酵液通過石油醚萃取，硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯洗脫，得到的脂肪酸經(jīng)甲酯化處理，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進行鑒定。結(jié)果：鑒定出4種脂肪酸成分。結(jié)論：黑曲霉（Aspergillus niger xj）發(fā)酵液中的脂肪酸成分主要為亞油酸、6-十八碳烯酸、14-甲基十五烷酸和硬脂酸。

黑曲霉；發(fā)酵液；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜法

黑曲霉屬于真菌中的一個常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，因其所產(chǎn)酶類豐富，所以在工業(yè)應(yīng)用中是最常見的菌種之一。真菌中含有多種多不飽和脂肪酸，是花生四烯酸（ARA）、γ-亞麻酸（GLA）、亞油酸（LA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA） 等脂肪酸的重要來源。多不飽和脂肪酸（PUFAs） 可以調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，在抗過敏、抗炎癥，降低心血管疾病的發(fā)病率，輔助改善記憶、輔助兒童智力發(fā)育，延緩衰老等方面具有重要的生理作用。但關(guān)于黑曲霉發(fā)酵液的化學(xué)成分方面尤其是發(fā)酵液中揮發(fā)油成分的研究工作較少，為進一步對黑曲霉的活性物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，我們選取貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所提供的黑曲霉（Aspergillus niger xj）的發(fā)酵液為研究對象，用石油醚對發(fā)酵液進行萃取，經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯洗脫，得到的脂肪酸經(jīng)甲酯化處理后，通過氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行分析研究，從中鑒定出4種脂肪酸成分。

1 儀器與材料

1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger xj），貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCCNO：M206021。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g切塊，用水煮沸30 min，紗布過濾，收集濾液加葡萄糖20 g，瓊脂20g，水補足1000mL，pH自然。滅菌條件：121℃，30 min（以下滅菌條件與此相同）。

PDA液體培養(yǎng)基：配方同上，未加瓊脂。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏：3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15 g～20 g，水補足l 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 主要試劑與設(shè)備

無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇等均為分析純。

柱層析硅膠G；薄層層析用薄層板為GF254/CMC硬板，規(guī)格10 cm×3 cm。

HP6890/HP5973MS氣質(zhì)聯(lián)用儀；R-201-B-II型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-3型循環(huán)真空水泵；SW-CJ-IBV型無菌工作臺。

2 方 法

2.1 菌株液體發(fā)酵

將黑曲霉（Aspergillus niger xj） 菌株接種于PDA固體斜面，27℃培養(yǎng)3 d～4 d，活化2～3代。挑取生長良好的活化菌株斜面，接入100 mL或500 mL三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中，27℃、150 r/min，培養(yǎng)3 d作為種子液備用。按總體積10%（v/v）的比例將種子液轉(zhuǎn)接到13 L或19 L發(fā)酵罐PDA液體培養(yǎng)基中，28±1℃，攪拌速度200 r/min～300 r/min，通氣量控制在1 L/min～2 L/min，培養(yǎng)5 d終止發(fā)酵。4層無菌紗布過濾除去菌絲體，得其發(fā)酵液于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試樣品的制備

發(fā)酵液用石油醚萃取，減壓回收溶劑，得到供試樣品石油醚項和水項。

2.3 石油醚項化學(xué)成分研究

2.3.1 樣品的分離

取石油醚項進行硅膠柱層析，用V（石油醚）V（乙酸乙酯） =1∶0～8∶1進行梯度洗脫，得到油狀物質(zhì)，經(jīng)薄層層析分析，為脂肪酸類成分。

2.3.2 樣品的甲酯化

取54 mg油狀物質(zhì)于錐形瓶中，加入20 mL苯-石油醚（體積比1∶1） 溶解，再加0.2 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液10 mL，振蕩均勻，在40℃水浴中恒溫30 min，冷卻，加入20 mL蒸餾水，搖勻，靜置，待分層清晰后取上清液減壓回收溶劑，得到甲酯化產(chǎn)物。

2.4.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：HP-5MS（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；柱溫 50 ℃（保留 2 min），升溫至 280 ℃（5℃/min），保持3 min；汽化室溫度為250℃；以高純氦為載氣；柱前壓7.62 psi（0.53 kg/cm2），載氣流量1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；接口溫度280℃；離子源溫度230℃；倍增器電壓1 785 V；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；質(zhì)量范圍10 amu～550 amu；溶劑延遲3 min。

3 結(jié)果與討論

通過GC-MS對甲酯化后的樣品進行分離，總離子流如圖1所示。通過HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合Nist98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫和WILEY質(zhì)譜圖庫解析，并通過面積歸一化法計算每個成分的含量，結(jié)果見表1。

圖1 黑曲霉發(fā)酵液中脂肪酸總離子流圖

表1 黑曲霉發(fā)酵液中脂肪酸化學(xué)成分及其相對百分含量

序號保留時間（min）化合物名稱 分子量分子式 含量g/100g 3 26.670 6-octadecenoic acid，methyl ester（6-十八碳烯酸甲酯）296 C19H36O248.112 4 27.094 octadecenoic acid，methyl ester（硬脂酸甲酯）298 C19H38O23.215

從表1可看出，黑曲霉的發(fā)酵液中共鑒定出4種脂肪酸，其中十八碳烯酸含量最高，含量為48.112g/100g，其次是亞油酸，含量為41.919g/100 g，多不飽和脂肪酸占90.031 g/100 g。

與黑曲霉的菌絲體的揮發(fā)成分相比較，兩種組分中都含有亞油酸和十八碳烯酸，特別是十八碳烯酸在菌絲體和發(fā)酵液中含量都較高；但在菌絲體中含量較高的三十二碳烷酸在發(fā)酵液中未檢出，而發(fā)酵液中所含的甲基十五烷酸在菌絲體中則未檢出。

黑曲霉發(fā)酵液石油醚項的主要成分亞油酸是人體必需脂肪酸，共軛亞油酸（Conjugated LinoleicAcid，CLA） 是亞油酸的異構(gòu)體，對人類黑色素腫瘤，結(jié)腸直腸癌細胞及乳腺癌細胞培養(yǎng)物有毒殺作用，可以減少動脈壁上脂質(zhì)斑的形成與沉積，防止動脈粥樣硬癥的發(fā)生。硬脂酸能部分降低膽固醇的溶解，硬脂酸能部分降低膽固醇的溶解,同時可能通過調(diào)節(jié)膽酸的生成，從而降低血清和肝臟中膽固醇含量。有關(guān)10-十八碳烯酸研究的報道較少，其有何特殊的功能及用途有待進一步研究。

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Analysis ofthe fatty acid from Aspergillus niger xjfermentation broth

WANGQiang1**FENGHuan-peng2LIUWu-juan1LI Zhu1***CHENQing2
1（College oflife science，Guizhou university，Guiyang550025，China）2（The chemistrydepartment ofscience college ofGuizhou university，Guiyang550025，China）

Objective：To study chemical constituents of fatty acid from A Aspergillus niger xj fermentation broth.Methods：After being cultured in PDA liquid medium，the fatty acid from Aspergillus niger xj was extracted by petroleum ether from the fermentation broth，separated by silica gel column chromatography method，eluted with petroleumether and ethyl acetate，then separated and analysed byGC-MS.Results：4 compounds were separated and identified.Conclusion The major fatty acids in Aspergillus niger xj fermentation broth including octadecadienoic acid，octadecenoicacid，pentadecanoicacidandoctadecanoicacid.

Aspergillus niger xj；fermentation broth；fattyacid；GC-MS

TS201.2+5

A

1673-6004（2012）02-0031-03

畢節(jié)地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)科技合作專項項目（201004）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)計劃項目（20113053）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（20102065）

** 王嬙，女，1982年生，2007年畢業(yè)于四川大學(xué)微生物學(xué)專業(yè)，碩士，講師

*** 李祝，通訊作者，Email：zhuliluck@163.com

2012-04-08

2012-05-13