高產(chǎn)Nisin和高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌共生株篩查

弓耀忠 王 呈

（山西省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，太原 030012）

高產(chǎn)Nisin和高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌共生株篩查

弓耀忠*王 呈

（山西省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，太原 030012）

通過對10株產(chǎn)Nisin乳酸菌株和10株產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株進(jìn)行培養(yǎng)、篩選和測定，篩選出3株高產(chǎn)Nisin的乳酸菌株和3株高產(chǎn)LABEPS的乳酸菌株，進(jìn)而對3株高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株和3株高產(chǎn)Nisin乳酸菌株進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵試驗(yàn)，最終篩選出可共生的高產(chǎn)Nisin乳酸菌株和高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株各1株。

Nisin；LAB EPS；乳酸菌；共生

乳酸鏈球菌素（Nisin） 亦稱乳酸鏈球菌肽或音譯為尼辛，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，由34個氨基酸殘基組成。食用后在人體的生理pH條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其他抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會與其他抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑?？蓮V泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、罐頭、海產(chǎn)品、飲料、果汁飲料、液體蛋及蛋制品、調(diào)味品、釀酒、烘焙食品、方便食品、香基香料、化妝品等中。

胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)：是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外、易與菌體分離、分泌到環(huán)境中的水溶性多糖，屬于微生物的次級代謝產(chǎn)物，對微生物的生長有重要意義。

目前關(guān)于乳酸鏈球菌素和胞外多糖已有大量的文獻(xiàn)報道，但研究高產(chǎn)乳酸鏈球菌素菌株和高產(chǎn)胞外多糖菌株之間共生關(guān)系的文獻(xiàn)鮮有報道。本文通過對10株產(chǎn)Nisin乳酸菌株和10株產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株進(jìn)行培養(yǎng)、篩選和測定，篩選出3株高產(chǎn)Nisin的乳酸菌株和3株高產(chǎn)LAB EPS的乳酸菌株，進(jìn)而對3株高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株和3株高產(chǎn)Nisin乳酸菌株進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵試驗(yàn)，最終篩選出可共生的高產(chǎn)Nisin乳酸菌株和高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株各1株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本試驗(yàn)所用的乳酸菌株為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis），其菌種編號為 LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、LE03、LE04、LE05。所用明串珠菌(Leuconostoc lactis)菌種編號為 Leu02、Leu03、Leu04、Leu05、 Leu06、 Leu07、 Leu08、 Lvan02、 Lvan04、Lvan05。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 菌株保藏及傳代培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基。

1.1.2.2 種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基。

1.1.2.3 乳鏈菌肽效價測定培養(yǎng)基

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計：胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.5%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、Na2HPO4·12H2O 0.2%、瓊脂1.5%、pH 6.8，0.55×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（代血漿培養(yǎng)基）

蔗糖 130.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4g、瓊脂15g、蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2。

1.1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基

a）脫脂牛乳培養(yǎng)基：采用新鮮無抗牛乳，經(jīng)脫脂后加入蔗糖（12 g/L） 和植物蛋白胨（35g/L），在115℃滅菌15 min。

b） 代血漿培養(yǎng)基：蔗糖130.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4 g、瓊脂15 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0～7.2。

c） 改良MC培養(yǎng)基。

1.2 分析方法和所用儀器

1.2.1 菌種稀釋液濃度測定

用721型分光光度計在600 nm處測定稀釋后菌懸液的光密度，以同樣稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 乳鏈菌肽效價測定

根據(jù)WHO規(guī)定，1 μg標(biāo)準(zhǔn)批樣商品乳鏈菌肽為1個國際單位。1 μg純?nèi)殒溇牡男r為40個國際單位。測定指示菌為黃色微球菌（Micrococcus flavus） NCIB8166。

1.2.3 溶液pH值的測定

用pH M82型標(biāo)準(zhǔn)酸度計測定溶液的pH。

1.2.4 菌種活化

菌種首先在MRS培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24 h，并在4℃下冷藏備用。發(fā)酵試驗(yàn)中菌種接種量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，并按試驗(yàn)要求進(jìn)行培養(yǎng)和測定。

1.2.5 胞外多糖的分離

發(fā)酵液采用12 000 r/min（4℃） 離心30 min，取上清液加3倍體積濃度95%的冷酒精沉淀24 h，于12 000 r/min（4℃） 離心30 min，重復(fù)3次，沉淀物溶于重蒸水中，并于4℃下透析24 h。

1.2.6 分析方法

光密度采用721分光光度計測定；pH值用酸度計測定；總糖含量采用硫酸——蒽酮法測定,以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 拮抗試驗(yàn)

a） 在改良 MC培養(yǎng)皿上，將 LA02、LA09、LA10和Leu02、Leu04、Lvan04兩兩劃十字線，看其有無拮抗性。

b）在改良MC培養(yǎng)皿上，加上NCIB8166指示菌，將 LA02、LA09、LA10 和 Leu02、Leu04、Lvan04兩兩劃十字線，確定其無拮抗性。

c）將無拮抗性的菌株兩兩在脫脂牛乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將其在代血漿培養(yǎng)皿上分離，確定其在脫脂牛乳中無拮抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株疑似產(chǎn)N i si n乳酸菌株培養(yǎng)、篩選結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)Nisin乳酸菌株篩選結(jié)果

通過試驗(yàn)，確定LA02、LA09和LA10高產(chǎn)Nisin，其試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 LA02、LE03、LA09和LA10抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 對LA02、LA09和LA10產(chǎn)Nisin的效價測定

將乳酸乳球菌LA02、LA09和LA10種子接于MRS肉湯培養(yǎng)基中，32℃靜止培養(yǎng)36 h，測定發(fā)酵液的光密度、pH值及乳鏈菌肽效價。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同菌株發(fā)酵液的光密度、pH值及乳鏈菌肽效價

從表1的結(jié)果可知，LA02、LA09和LA10菌株高產(chǎn)Nisin。

2.2 10株產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株培養(yǎng)、篩選結(jié)果

10株產(chǎn)LAB EPS乳酸菌株在代血漿培養(yǎng)基的發(fā)酵數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同菌株的發(fā)酵數(shù)據(jù)

從表2的結(jié)果可知，Leu02、Leu04、Lvan04的LAB EPS產(chǎn)量較高。

2.3 共生關(guān)系

研究高產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌與高產(chǎn)LAB EPS乳酸菌的共生關(guān)系，結(jié)果見表3、圖2、圖3、圖4。

表3 共生實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 在改良MC培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)結(jié)果

圖3 在加有NCIB8166指示菌的改良MC培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)結(jié)果

圖4 在脫脂牛乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)及其分離結(jié)果

通過上面的試驗(yàn)可確定高產(chǎn)Nisin的菌株LA02和高產(chǎn)EPS的菌株Lvan04可共生。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出了能夠共生的高產(chǎn)Nisin菌株LA02和高產(chǎn)EPS菌株Lvan04，為食品工業(yè)新產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

［1］劉燕，李文獻(xiàn)，王少武.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株篩選與鑒定［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，134（1）：21-25.

［2］顧瑞霞，劉愛萍，駱承庠.不同胞外多糖產(chǎn)生特性的乳酸菌菌種對酸乳品質(zhì)的影響［J］.乳品工業(yè)，2002，30（5）：5-7.

［3］潘道東，吳玲.高產(chǎn)胞外多糖（EPS）乳酸菌菌株的篩選與鑒定［J］.生物工程，2007，28（3）：171-174.

［4］李增利.NISIN的生產(chǎn)、提純和檢測［J］.中國食品添加劑，2004，28（4）：64-68.

Screening of lactic acid bacteria of the highest yield of nisin LAB EPS symbiotic strains

GONG Yao-zhong*WANG Cheng
（Shanxi province food quality inspection and testing center，Taiyuan 030012，China）

Three strains of lactic acid bacteria and three strains of lactic acid bacteria of the high yield of LAB EPS are screened based on 10 strains producing Nisin lactic acid bacteria strains and 10 strains of producing LAB EPS strain of lactic acid bacteria were cultured，screened and determinated.One strain with high yield of Nisin strains of lactic acid bacteria symbiotic with one strain with high yield of EPS strains of lactic acid bacteria is screened by fermentation experiment.

nisin；LAB EPS；lactic acid bacteria；symbiosis

TS252.54

A

1673-6004（2012）01-0038-03

* 弓耀忠，男，1973年出生，2007年畢業(yè)于山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，碩士，高級工程師

2011-12-07