黃芩苷對(duì)白血病細(xì)胞耐藥株逆轉(zhuǎn)耐藥效果及機(jī)制研究

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血液科（西安710032） 楊莉潔 趙 挺 白慶咸 董紅娟

目前白血病的治療大多采用聯(lián)合化療，盡管生存期已明顯延長(zhǎng)，但仍有逾30%的病人發(fā)生多藥耐藥而耐藥細(xì)胞是否具有逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制如何仍未有文獻(xiàn)報(bào)道。本課題擬觀察黃芩苷對(duì)人白血病耐藥株K562／Adr的逆轉(zhuǎn)作用并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。導(dǎo)致化療失敗。多藥耐藥（Multidrug resistanee，MDR）已成為白血病化療及白血病病人長(zhǎng)期無病生存的主要障礙［1］。因此，尋找克服 MDR的治療措施對(duì)白血病的治療藥物具有重大意義。目前MDR逆轉(zhuǎn)劑主要存在的問題有效果不佳，部分逆轉(zhuǎn)藥物副作用較大等不足，研究報(bào)道，一些中藥提取物對(duì)腫瘤的多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用［2］，且此類藥物毒副作用明顯低于經(jīng)典逆轉(zhuǎn)劑，已逐漸成為MDR逆轉(zhuǎn)劑篩選的熱點(diǎn)。黃芩苷是由中藥黃芩中提取出來的重要成分之一，有研究顯示它可能具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［3］，但其對(duì)白血病

材料與方法

1 細(xì)胞系 人白血病親本細(xì)胞株K562為本實(shí)驗(yàn)室存留，耐藥株細(xì)胞K562／Adr購(gòu)于南京凱基生物公司。

2 主要試劑 黃芩苷（純度95%）購(gòu)于Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司，Trizol購(gòu)于Invitrogen公司。PCR Taq酶購(gòu)于大連寶生物公司。

3 方 法

3．1 抑制率及逆轉(zhuǎn)作用評(píng)價(jià)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞K562／Adr，細(xì)胞密度5×104／ml，接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80%匯合率時(shí)以倍比稀釋的方法由高到低分別加入由含5、10μg／ml黃芩苷完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的阿霉素（Adriamycin，Adr）（800、400、200、100、50μg／ml），另設(shè)空白對(duì)照組（細(xì)胞＋培養(yǎng)液）、調(diào)零孔（培養(yǎng)液），藥物作用48h后，使用MTT法檢測(cè)各組的抑制率：抑制率（%）（Inhibition rate，IR）＝（1－實(shí)驗(yàn)孔OD值／對(duì)照孔OD值）×100%；耐藥指數(shù)（Resistance index，RI）＝IC50（耐藥細(xì)胞）／IC50（親本細(xì)胞）；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（Reversal fold，RF）＝IC50（耐藥細(xì)胞單用化療藥物）／IC50（耐藥細(xì)胞聯(lián)用化療藥物＋逆轉(zhuǎn)劑）；相對(duì)逆轉(zhuǎn)率（relative reversal rate，RRR）＝（IC50（耐藥株單用化療藥）－IC50（耐藥株化療藥＋逆轉(zhuǎn)劑））／（IC50（耐藥株單用化療藥）－IC50（親本株單用化療藥）），RRR≥1代表完全逆轉(zhuǎn)，RRR﹤1代表部分逆轉(zhuǎn)。

3．2 K562／ADR細(xì)胞中ADR蓄積測(cè)定：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562／ADR細(xì)胞，以1×106／孔接種于6孔板，加入不同濃度黃芩苷，懸于含5μg／ml ADR的完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于1ml冰冷的PBS中，立刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADR的蓄積，每組各檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞。

3．3 MDR相關(guān)基因的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562／Adr，以0．25%的胰蛋白酶消化后形成細(xì)胞懸液，接種6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度5×105／ml，2ml／孔，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80%匯合率時(shí)以倍比稀釋的方法由高到低分別加入由完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的黃芩苷（10、5μg／ml），另設(shè)空白對(duì)照組（細(xì)胞＋培養(yǎng)液），藥物作用48h后，TRizol法提取RNA，RT－PCR檢測(cè) MDR相關(guān)基因MDR1、MRP以及LRP基因的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，4個(gè)基因相應(yīng)的PCR引物，見表1。

表1 目的基因引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)胞增殖抑制率、IC50值比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，基因表達(dá)水平先采用Image J軟件計(jì)算出灰度值，再采用t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P＜0．05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 阿霉素對(duì)K562細(xì)胞和K562／Adr細(xì)胞的抑制作用：MTT結(jié)果顯示Adr作用于K562／Adr耐藥細(xì)胞的IC50值約為12．099μmol／ml，作用于 K562細(xì)胞的IC50值為0．696μmol／ml，K562／Adr細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性顯著低于K562細(xì)胞（P＜0．001），其耐藥倍數(shù)為17．384倍（圖1）。

圖1 阿霉素對(duì)K562細(xì)胞和K562／Adr細(xì)胞的抑制作用

2 黃芩苷對(duì)K562細(xì)胞和K562／Adr細(xì)胞的抑制作用：MTT結(jié)果顯示黃芩苷對(duì)K562親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞均具有抑制作用，對(duì)K562／Adr耐藥細(xì)胞的IC50值約為16．223μg／ml，對(duì)K562細(xì)胞的IC50值僅為0．091μg／ml（圖2）。

圖2 黃芩苷對(duì)K562細(xì)胞和K562／Adr細(xì)胞的抑制作用

3 黃芩苷對(duì)K562／Adr細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用：黃芩苷（10μg／ml、20μg／ml）聯(lián)合 Adr（0．5－12．8μmol／ml）（簡(jiǎn)稱AB10組、AB20組）對(duì)K562／Adr的抑制率分別為（3．85%、6．39%、17．14%、34．26%、52．99%、70．53%和88．18%）以及（5．86%、11．38%、30．43%、51．13%、74．44%、88．75%和94．21%），聯(lián)用黃芩苷后的IC50分別為2．859μmol／ml及1．549μmol／ml，較單用Adr具有顯著性差異（P＜0．01，圖3）。

圖3 黃芩苷對(duì)K562／Adr細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用

RF（AB10）為4．230，RF（AB20）為7．812；RRR（AB10）及RRR（AB20）分別為0．81及0．93，黃芩苷（10μg／ml、20μg／ml）對(duì) K562／Adr的耐藥逆轉(zhuǎn)為部分逆轉(zhuǎn)作用。

4 黃芩苷對(duì)K562／Adr細(xì)胞內(nèi)Adr蓄積的影響：0、10、20μg／ml黃芩苷分別與5μmol／ml Adr作用2h后，K562／ADR細(xì)胞內(nèi)Adr的熒光強(qiáng)度分別為1．058±0．155、1．525±0．213和2．217±0．356，各劑量組之間存在顯著性差異 （P＜0．05）（圖4）。

5 黃芩苷對(duì)K562／Adr細(xì)胞 MDR1、MRP1以及LRP基因表達(dá)的影響：RT－PCR結(jié)果顯示10μg／ml和20μg／m黃芩苷處理后，K562／Adr細(xì)胞中 MDR1以及MRP1mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，其中以MDR1表達(dá)變化最為顯著；LRP mRNA表達(dá)水平未見明顯改變（圖5）。因此，篩選安全有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑成為了腫瘤化療研究的一大熱門課題。

圖5 黃芩苷對(duì)MDR1、MRP1以及LRP基因表達(dá)的影響

黃芩苷（Baicalin）是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來的黃酮類化合物［4］，根據(jù)中醫(yī)中藥理論，黃芩具有解熱、降壓、利膽、保肝、鎮(zhèn)靜、抗菌等藥理作用，而黃芩苷則是黃芩的一個(gè)重要有效成分［5］。由于該藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，毒副作用較低，因此具有良好的MDR逆轉(zhuǎn)劑前景。本課題選取白血病耐藥細(xì)胞株，根據(jù)經(jīng)典的MDR逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩苷逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細(xì)胞株MDR的效果進(jìn)行了評(píng)估，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株K562／Adr具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。在不直接引起細(xì)胞凋亡的濃度下（10、20μg／ml），黃芩苷可對(duì)白血病耐藥細(xì)胞的MDR進(jìn)行部分逆轉(zhuǎn)，顯著提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度。

討 論

多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后對(duì)其它結(jié)構(gòu)、細(xì)胞靶點(diǎn)和作用機(jī)制不同的多種抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。截至目前，腫瘤研究者發(fā)現(xiàn)了諸多MDR逆轉(zhuǎn)劑，如最經(jīng)典的鈣通道阻滯劑維拉帕米，還有其它如鈣調(diào)節(jié)蛋白抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、寡核苷酸、免疫抑制劑、甾體類激素等。但是這些具有逆轉(zhuǎn)MDR作用的藥物大多存在毒副作用較大的缺陷，限制了其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。

MDR的產(chǎn)生是多機(jī)制、多途徑、多環(huán)節(jié)的過程，目前認(rèn)為白血病細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制與ATP結(jié)合的盒式（ATP binding cassette，ABC）運(yùn)輸?shù)鞍准易迕芮邢嚓P(guān)，該蛋白家族的主要成員包括：①P－糖蛋白（P－gp）介導(dǎo)的藥物泵出；②MRP介導(dǎo)的藥物泵出；③LRP介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)；④乳癌耐藥蛋白BCRP的參與等。不同的藥物泵化療藥的作用也不盡相同，例如P－gp主要泵出蒽環(huán)類、生物堿類藥物，MRP轉(zhuǎn)運(yùn)多柔比星的作用更為明顯，而LRP則與順鉑類藥物耐藥關(guān)系密切。為了探討黃芩苷逆轉(zhuǎn)作用的分子機(jī)制，我們采用RTPCR法檢測(cè)了白血病耐藥細(xì)胞株在黃芩苷處理后耐藥相關(guān)基因的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩苷可顯著下調(diào)MDR1基因的表達(dá)，對(duì)MRP基因也有一定的抑制作用，但對(duì)LRP基因的影響不甚明顯。這提示黃芩苷的MDR逆轉(zhuǎn)作用可能主要在于抑制了耐藥細(xì)胞中MDR1基因的表達(dá)。阿霉素屬于抗生素類抗腫瘤藥物，已有研究證實(shí)P－cp可將阿霉素泵出細(xì)胞外而導(dǎo)致MDR［6］，因此黃芩苷抑制MDR1基因的表達(dá)后腫瘤耐藥細(xì)胞中的阿霉素蓄積水平升高，保證了藥物的殺傷作用。

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