針對livin的siRNA表達載體的構建

劉敏麗，魏曉麗，張生軍，崔軼霞，杜雨柔，韓振奎

(1.延安大學醫(yī)學院病理學教研室;2.延安大學附屬醫(yī)院，陜西 延安 71600)

近年來對RNA干擾的研究表明，小干擾RNA(siRNA)能高效、特異的抑制特定基因的表達［1］，人們利用其生物學機制可以快速便捷的抑制細胞中某些基因，從而分析該基因在細胞中的功能，成為基因功能研究的一種新方法［2］?；谝陨侠碚摚覀冞x取凋亡抑制蛋白家族的的新抑制因子livin基因［3］，構建針對livin的表達載體，降低或沉默livin基因表達后是否有效地抑制胃癌細胞增殖，為胃癌的基因治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高效感受態(tài)DH5α細菌購自博大泰克公司。siRNA表達載體試劑盒pSilencerhygroTM購自Ambion公司，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等購于大連TaKaRa公司。QIAprep@Spin Miniprep Kit購自Promega公司。

1.2 siRNAs序列的設計與合成

依據(jù)Ambion公司推薦的設計導向，按照 gen-Bank報道的 livin mRNA序列(Livin’α為 BC 014475，Livin’β為 AF311388)用 Ambion公司的siRNA在線軟件設計，輸入livin基因的開放閱讀框，得到19個粗篩位點。并根據(jù)siRNA設計原則挑選2條發(fā)卡狀結(jié)構的siRNA序列模板，經(jīng)BLAST檢索確認與livin以外的人類已知基因序列無同源性。DNA寡核苷酸由siRNA19個核苷酸正義鏈連接9個核苷酸(TTCAAGAGA)，及siRNA的反義鏈構成。將2條siRNA設計為相應的DNA單鏈，兩端分別加上BamHⅠ和hindⅢ酶切位點，北京奧克公司合成。

圖1 退火后發(fā)夾狀siRNAFig.1 Annealed hairpin siRNA template insert

1.3 退火

根據(jù)SilencerTMExpress Kit說明書，將所合成的2對DNA單鏈用緩沖液溶解。0.4μl正義DNA鏈(1 μg/μl)0.4 μl反義 DNA 鏈(1 ug/μl)，9.2 μl退火 Buffer 46μl。三者混勻，90℃30 min。37℃孵育10 min。其結(jié)構如圖1所示:其中N為所篩選出的由19個核苷酸組成的靶序列或者其反義鏈。再緩慢降至30℃，維持30 min，緩降至4℃后，-20℃保存。

1.4 酶切、連接

對載體 pSilenceTM3.1 hygro進行 BamHⅠ 和hindⅢ雙酶切，然后對酶切產(chǎn)物進行純化回收。體系為DNA溶液中加入3 M的NaAc 1/9體積，充分混勻。加入兩倍體積的冰乙醇，冰浴30 min;0℃以13000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清;沉淀DNA，加入1 ml 70%乙醇，再次同樣條件離心2 min;吸上清，所剩固體為DNA，測定濃度。將退火后的siRNA片段與線性化的pSilencerTM3.1質(zhì)粒表達載體連接。體系為1μl稀釋退火片段Livin與1μl線性化質(zhì)粒載體溶解在1μl 10×T4連接緩沖液中，加入1μl T4 DNA連接酶，6μl的無核酶三蒸水，4℃過夜。

1.5 轉(zhuǎn)化、搖菌

用重組載體分別轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細胞。步驟為連接反應產(chǎn)物及載體試劑盒所提供的陰性對照質(zhì)粒各2μl，混勻后置冰上30 min，42℃熱休克30 s，立即置冰上2 min。加入450μl LB培養(yǎng)基，225 rpm 37℃振搖1 h，置于冰上;在含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)板上涂布均勻，分別標為siRNA1，siRNA2，避光放置待菌液吸干后，倒置培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取陽性克隆進行序列測定。

1.6 提取質(zhì)粒

將正確插入siRNA的克隆大量擴增后，提取質(zhì)粒。于無菌試管中加入2 ml LB培養(yǎng)基，分別吸取2 μl plivin-siRNA 陰性對照、plivin-siRNA1、plivin-siRNA2菌液加入對應的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜;將菌液轉(zhuǎn)入1.5 ml Ep管中，標記;4000 r/min離心3 min，棄上清。Ep管倒置于吸水紙上，吸掉多余液體;用250μl Buffer P1溶液重懸細菌細胞。加入250μl Buffer P2溶液輕輕顛倒4～6次，加入350 μl Buffer N3溶液，立即顛倒4～6次;10000 g離心20 min，取上清液于另一新Ep管中。取出QIAprep Spin柱，將上清液加入 QIAprep Spin柱中;離心1 min，加500μl Buffer PB溶液洗QIAprep Spin柱，離心1 min。加750μl Buffer PE溶液洗柱，離心1 min，丟掉流出液體;取出QIAprep Spin柱，置于無菌1.5 ml Ep管中，加50μl Buffer EB到柱中央，靜置1 min，離心1 min;收集所得質(zhì)粒plivin-siRNA陰性對照、plivin-siRNA 1、plivin-siRNA 2，-20℃保存。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)siRNA設計原則所獲得的兩條siRNA

siRNAlivin1:正義鏈:5’-GAT CCG TCT GGC CTC CTT CTA TGA ttc aag aga CAT TCT CCA CAG TCA GACTttt ttt GGA AA-3’，反義鏈:3’-GCGAGA CCG GAG GAA GAT ACT aag ttc tct GTA AGA GGT GTC AGT CTG A aaa aaa CCT TTT CGA-5’。siRNAlivin2:正義鏈:5’-GAT CCG GAA GAG ACT TTG TCC ACA tta aag aga GAT CTT ACA TCT CTGAGT C ttt ttt GGA AA-3’，反義鏈:3’-GGC TGA GTC TGA AAC AGG TGT aag ttc tct CTA GAA TGT AGA GAC TCA G aaa aaa CCT TTT CGA-5’。

2.2 質(zhì)粒酶切鑒定

Plivin-siRNA1和 plivin-siRNA2質(zhì)粒經(jīng) hindⅢ和BamHⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳，在預期分子量大小216 bp和278 bp的區(qū)域出現(xiàn)特異性陽性條帶，圖2所示。酶切結(jié)果表明，設計兩條siRNA均為陽性重組載體，并將每個質(zhì)粒挑選一個克隆送北京奧克公司鑒定，結(jié)果證實合成的序列準確的克隆到pSilenceTM3.1 hygro載體，重組載體合成正確。

圖2 重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig2 Restriction enzyme anal ysis of recombinant plasmid

3 討論

近年來對RNA干擾的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應的基因沉默［4］。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)被稱為RNA干擾(RNAi)。siRNA即小干擾RNA，能干擾人體本身的RNA信使功能，導致相應蛋白質(zhì)無法合成，從而能起到“關閉”特定基因的作用。人工體外合成的小片段RNA，由約20個堿基對組成，包括5個磷酸鹽，2個核苷和3個懸臂。通過轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)，此siRNA含有2～3nt的3’突出端，被輸送到RISC(RNA-in-duced silencing protein complex)，siRNA作為引導序列引導RISC與同源性的mRNA結(jié)合，解旋酶催化 mRNA與siRNA的正義RNA鏈相互交換，siRNA的反義鏈與同源mRNA結(jié)合后，核酸酶在mRNA與siRNA反義鏈所形成的雙鏈區(qū)的5’起始端下游7～10個核苷酸處(也就是雙鏈區(qū)的靠近中間位置)切斷mRNA，降解的mRNA被釋放后，siRNA雙鏈重新形成，可以繼續(xù)降解同源的 mRNA［5］。

目前關于siRNA的設計軟件很多，但基本上都根據(jù)Tuschl的實驗［6］，例如從目標序列的開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找AA二連序列后的19個堿基序列。避開5’和3’端的非編碼區(qū)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些非編碼區(qū)結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響核酸內(nèi)切酶復合物結(jié)合mRNA，從而影響siRNA的效果。把GC比在40-55%直接的靶基因序列作為優(yōu)選，比較潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫，排除和其他編碼去序列/EST同源的序列。同時應設立陰性對照，陰性對照的siRNA通常是將選中的siRNA的序列打亂，但要保證它和其他基因沒有同源性。BLAST對比結(jié)果中，Score得分值越高說明同源性越好，Expect期望值越小比對結(jié)果越好，說明因某些原因引起的誤差越?。?］。

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，按其發(fā)病率排在第4位。在中國、日本胃癌的發(fā)病率最高，大約占全球胃癌發(fā)病例數(shù)的50%［8］。因此能夠正確的預防和治療胃癌，具有重要的現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制蛋白livin在胃癌等多種腫瘤組織中高表達，如果只靶向殺傷胃癌細胞而對正常細胞的傷害極小，這樣才能有效的治療胃癌，這也是治療癌癥的重要方向。因此，針對某些受體、基因或關鍵物質(zhì)的靶向治療也成為腫瘤研究的熱點。我們針對人Livin mRNA，選擇特異性siRNA靶序列，構建了靶向Livin基因siRNA載體，為進一步轉(zhuǎn)染該載體的人胃癌細胞株SGC7901的后續(xù)實驗做準備，酶切和測序結(jié)果表明成功構建了針對Livin基因的siRNA載體，這為以后的實驗打下了良好的基礎。

［1］Ga?lle Breton，Bader Yassine-Diab，Lillian Cohn et al，siRNA Knockdown of PD-L1 and PD-L2 in Monocyte-Derived Dendritic Cells only Modestly Improves Proliferative Responses to Gag by CD8+TCells from HIV-1-Infected Individuals［J］.Journal of Clinical Immunology，2009，29(5):637-645.

［2］Jeff Kiefer，Hongwei H Yin，Qiang Q.Que.High-Throughput siRNA screening as a method of perturbation of biological systems and Identification of targeted pathways coupled with compound screening［J］.Methods in Molecular Biology，2009，563(3):275-287.

［3］Grzybowska-Izydorczyk O，Smolewski P.The role of the inhibitor of apoptosis protein(IAP)family in hematological malignancies［J］.Postepy Hig Med Dosw，2008，14;62(2):55-63.

［4］Chunsoo Kim，Yuhan Lee，Soo Hyeon Lee，et al.Selfcrosslinked polyethylenimine nanogels for enhanced intracellular delivery of siRNA［J］.Macromolecular Research，2011，19(2):166-171.

［5］Zhen-Yu Ding，Ze-Gui Li，Yi-Zhan Xing，et al.The construction of siRNA plasmid targeting mouse HIF-1αand in vitro study of its inhibition effect［J］.Neuroscience Bulletin，2010，25(3):122-130.

［6］Bérangère Langlet-Bertin，Christian Leborgne，Daniel Scherman，et al.Design and Evaluation of Histidine-Rich Amphipathic Peptides for siRNA Delivery［J］.Pharmaceutical Research，2010，27(7):1426-1436.

［7］Chunsoo Kim，Yuhan Lee，Soo Hyeon Lee.Self-Crosslinked polyethylenimine nanogels for enhanced intracellular delivery of siRNA［J］.Macromolecular Research，2011，19(2):166-171.

［8］Toshimasa Tsujinaka，Kazumasa Fujitani，Motohira Hirao·Yukimori Kurokawa.Current status of chemoradiotherapy for gastric cancer in Japan［J］.Int J Clin Oncol，2008，13:117-120.