荔枝核降血糖有效部位的研究（一）

姜振國，任 ，林 ，徐多多，潘 志，高其品

（長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117）

糖尿病是嚴重威脅人類健康的慢性病之一，其發(fā)病率僅次于心腦血管疾病、癌癥而居第三位［1］。中藥荔枝核為無患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子。研究［2］表明，荔枝核具有多種藥理作用，臨床治療肝臟疾患、糖尿病、腫瘤等方面具有較好療效。在前人工作的基礎上，進一步研究荔枝核降血糖作用，并對其化學性質進行深入分析。為進一步研究構效關系和新藥開發(fā)打下基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量（220±20）g，購于長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心，合格證：SCXK（吉）2003-0004。

1.2 藥材及試劑 荔枝核（市場購）；0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（北京北化精細化學品有限公司）；鹽酸二甲雙胍片（河南興源制藥有限公司）；STZ（上海藍季科技發(fā)展有限公司）；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3·2·1·20，Type）（Sigma公司）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，EC223-189-3）（Sigma公司）；拜糖平（拜耳公司）。

1.3 實驗儀器 安妥超越Optium Xceed血糖儀（美國雅培公司）；3型酶標儀（美國熱電）；PHS-25數顯pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 荔枝核各部位的提取和分離 取荔枝核藥材50kg，粉碎，加8倍量的95％乙醇加熱回流提取4次，每次6h，濾過，合并提取液，濾液濃縮、干燥得95％乙醇提取浸膏（LCF）。將醇提浸膏用10倍量水溶解，加入95％的乙醇使其乙醇含量為80％，靜置過夜，離心，上清液回收乙醇至無醇味，經氯仿脫脂后，用水飽和正丁醇萃取，合并萃取液，回收正丁醇至無醇味，濃縮后得水飽和正丁醇萃取部位（BF）。將BF加4倍量蒸餾水溶解5次，合并水溶液，濃縮后得水溶部位（BFWD），沉淀干燥后得水不溶部位（BFWI）。

2.2 荔枝核各部位對α-葡萄糖苷酶抑制作用

2.2.1 樣品液的制備 取干燥至恒重的各提取物適量，精密稱定，加0.067mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）制成每毫升含1mg的溶液，按所需樣品濃度倍比稀釋。

2.2.2 α-葡萄糖苷酶活性測定方法 根據Pierre等［3］方法反應體系以PNPG為底物，在96孔板中加入樣品溶液40μL、0.007 1mg/mL a-D-葡萄糖苷酶溶液40μL，37℃保溫5min后，加入0.150 8mg/mL PNPG溶液20μL，反應30min，用0.1mol/L Na2CO3溶液100μL終止反應，于波長405nm處測定吸光度。酶活性抑制率=A空白-（A樣品-A背景）A空白×100％。A空白：不加樣品反應后的吸收值；A樣品：加入樣品反應后的吸收值；A背景：只加樣品的吸收值。

2.3 荔枝核95％乙醇提取物（LCF）對Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖作用

2.3.1 實驗方法 40只SD大鼠，隨機分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周適應環(huán)境。喂高糖高脂飼料4周后，禁食，測空腹血糖，一次性腹腔注射1％鏈尿菌素（STZ），30mg/kg體質量（現配），分別測給藥后24、72h斷尾取血血糖，取血糖值＞7.8mmol/L的大鼠重新分組［4-5］選取造模成功大鼠，隨機分組，空白組正常飼料喂養(yǎng)，模型組及給藥組高脂高糖飼料喂養(yǎng)，采用固定時間灌胃給藥方式進行，二甲雙胍（0.1g/kg體質量），荔枝核醇低劑量組（LCFL）（160mg/kg體質量），荔枝核醇高劑量組（LCFH，300mg/kg體質量），模型組、生理鹽水組分別給等量蒸餾水。

2.3.2 檢測指標 觀察高脂高糖糖尿病模型大鼠體征變化，檢測給藥2周后血糖變化。

2.4 BF、BFWD和BFWI總糖、總皂苷、總酚的含量測定

2.4.1 BF、BFWD和BFWI的總糖含量測定

2.4.1.1 標準曲線的制備 取干燥至恒重的葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每毫升含0.1mg的對照品溶液。分別吸取對照品溶液0、20、40、60、80、100μL置具塞試管中，分別加水使體積均為1mL后，再加入5％苯酚試液1.0mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL搖勻，放至室溫；以0管作為空白對照，用紫外-可見分光光度計于490nm處測定吸收度。

2.4.1.2 樣品液的制備 分別取干燥至恒重的BF、BFWD和BFWI 25mg置500mL容量瓶中，精密稱定，加水溶解至刻度，搖勻，按照上述方法測定吸收度。

2.4.2 BF、BFWD和BFWI的總皂苷的含量測定

2.4.2.1 標準曲線繪制 根據陳衍武等［6］的方法，取干燥至恒重的人參皂苷Re，精密稱定，加水制成每毫升含0.1mg的對照品溶液。分別吸取對照品溶液10、20、40、80、120、160、180、240μL人參皂苷Re對照液于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，60℃水浴加熱15min，立即以冰水冷卻5min，加入5mL冰醋酸，搖勻，靜置10min后，于λ=550nm處，測定吸光度。

2.4.2.2 樣品液的制備 取干燥至恒重的BF約25mg置500mL容量瓶中，精密稱定，加甲醇溶解至刻度，搖勻，精確量取樣品，按照上訴方法測定吸收度。

2.4.3 BF、BFWD和BFWI總酚的含量測定

2.4.3.1 沒食子酸標準曲線的制備 根據楊光明等［7］的方法，配置Folin-Ciocalteu試劑，置于冰箱中可以長期保存。取干燥至恒重的沒食子酸精密稱定，加水制成每毫升含0.1mg的對照品溶液。分別吸取對照品溶液以沒食子酸為對照品制作標準曲線分別精密吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4mL置于25mL量瓶中，向量瓶中依次加入10.0mL蒸餾水，再各加入Folin-Ciocalteu顯色劑2.0mL，充分振蕩后靜置6～8min，分別加入15％Na2CO3溶液2.0mL，搖勻，在室溫下避光放置反應2h。用分光光度計在波長765nm處測定吸光度A。

2.4.3.2 樣品液的制備 取干燥至恒重的BF 19.6mg置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使其濃度相當于784μg/mL的樣品液供分析用。按照上訴方法測定吸收度。

3 結果

3.1 荔枝核95％乙醇提取物（LCF）對α-葡萄糖苷酶抑制作用 見圖1。

圖1 LCF對α-葡萄糖苷酶抑制作用

圖1表明：LCF的抑制率與陽性藥（阿卡波糖）的抑制率在相同濃度下基本相同，LCF對酶的抑制活性呈劑量依賴關系。

3.2 LCF對高脂高糖糖尿病模型大鼠血糖的影響 見表1。

表1 對各組糖尿病大鼠血糖的影響 mmol/L

3.3 荔枝核各部位對α-葡萄糖苷酶抑制作用結果 取各提取物的濃度分別為0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1mg/mL時，測定酶抑制活性。結果見圖2。

圖2表明：LCF的抑制率與陽性藥（阿卡波糖）的抑制率在相同濃度下基本相同，但隨著對抑制組分的逐步純化，在相同濃度下各純化部位抑制率均高于阿卡波糖。其中在各濃度下BFWI的抑制率最高。

圖2 各組分對α-葡萄糖苷酶抑制作用

3.4 BF、BFWD和BFWI的總糖、總皂苷、總酚的含量測定結果

3.4.1 總糖含量 葡萄糖標準曲線的繪制配制葡萄糖標準溶液，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，建立回歸方程：A=0.078C+0.011（r=0.995 4），根據回歸方程，求得各部位的總糖含量見表2。

表2 各部位含量測定結果的比較 ％

3.4.2 總皂苷含量 人參皂苷Re標準曲線的繪制配制人參皂苷Re標準溶液，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制人參皂苷Re標準曲線，建立回歸方程：A=0.004 2C-0.051 5（r=0.997 6），根據回歸方程，求得各部位總皂苷含量見表2。

3.4.3 總酚含量 沒食子酸標準曲線的繪制配制沒食子酸標準溶液，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線，建立回歸方程：A=0.005 57C+0.005（r=0.999 0）。根據回歸方程，求得各部位的總酚含量，見表2。

4 討論

實驗結果表明，LCF對α-葡萄糖苷酶有很強的抑制作用，對Ⅱ型糖尿病大鼠也有很強的降血糖作用，因此選擇α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗作為活性跟蹤的手段。本實驗中，各提取物與陽性對照阿卡波糖的抑制率比較為BFWI＞BF＞BFWD＞LCF，即隨著對活性組分的逐步純化，活性部位逐步集中，從而證明選用本實驗的提取方法特別是對BF采用水溶解的分離方法是簡單、有效的。通過對它們化學性質的研究，BF、BFWD和BFWI的總糖和總酚含量均無明顯差別，而總皂苷的含量差別較大，分別為21.96％、6.54％、46.06％。綜上可以推斷皂苷類物質可能是抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效組分。本項研究工作確定了荔枝核的降血糖有效部位和該部分的化學性質，對其化學成分的分離、鑒定工作正在進行。

［1］劉霞，馮長根.酶抑制劑在抗糖尿病藥物中的應用研究［J］.中國醫(yī)學雜志，2003，38（2）：89-91.

［2］肖培根.新編中藥志：2卷［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2002：432.

［3］Pierre C，Roland R，Tremblay D.P-Nitrophenol-α-glucopyramosidas substrate for measurement of maltase activity in human seme［J］.J Clin Chem，1978，24：208-211.

［4］倪紅霞.高糖高脂飲食誘導的大鼠Ⅱ型糖尿病模型［J］.北華大學學報：自然科學版，2006，7（5）：40.

［5］沈亞非，徐焱成.高糖高脂膳食和鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病模型的建立［J］.實用診斷與治療雜志，2006，20（9）：51.

［6］陳衍武，武可泗，陳建宗.荔枝核皂苷含量測定方法［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2007，30（3）：45-46.

［7］楊光明，王棟，張芳芳，等.鐮形棘豆總黃酮和總酚的含量測定［J］.藥學與臨床研究，2009，17（5）：376-379.