姜黃根莖中姜黃素類成分含量的產(chǎn)地差異及其與環(huán)境因子的CCA分析

楊 旭，楊志玲，劉若楠，王 潔

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400)

姜黃(Curcuma longa L.)為姜科(Zingiberaceae)植物，其干燥根莖具有行氣破血、消積止痛、清心解郁的功效；其中的主要有效成分為姜黃素類化合物，包括姜黃素 (curcumin，Cur)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin，DMC)和雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin，BDMC)［1］?，F(xiàn)代藥理實驗結果表明：姜黃素類化合物是有效的臟器損傷保護劑，對肝、肺、胃損傷具有良好的修復作用［2-4］，可用于治療肝炎、肺炎、胰腺炎等多種急慢性炎癥［5］；還能抑制癌細胞增生和抗艾滋病，有很高的開發(fā)潛力［6-7］。

姜黃主產(chǎn)臺灣、福建、廣東、廣西、云南及西藏等省區(qū)，在東亞和東南亞也廣泛栽培［8］。目前規(guī)模較大的種植地在四川崇州和犍為一帶，廣東、廣西及云南等地也有零星種植。近年來，由于姜黃的收購價格連年下滑，造成其栽培面積急劇縮小。廣泛存在的藥材混亂流通現(xiàn)象導致不同產(chǎn)地的姜黃出現(xiàn)成分和活性的差異，而相關標準［9］對姜黃中姜黃素類成分的含量沒有明確要求，不能對姜黃的質量進行有效控制。因此，已有研究者對姜黃中姜黃素類成分的產(chǎn)地差異進行了比較分析［10-13］，但多側重于含量測定方法的探討，對不同產(chǎn)地姜黃素類成分的含量僅作描述，且基本未涉及藥材品質與環(huán)境因子相互關系的研究，只孤立地對化學成分含量的差異進行比較。

作者研究了不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分的含量差異，并運用典范對應分析(canonical correspondence analysis，CCA)方法探討其與氣候和土壤因子的相關性，旨在為姜黃生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

分別于2009年1月和2010年1月姜黃的收獲季節(jié)采集姜黃的新鮮根莖，采樣地點包括國產(chǎn)姜黃的主要產(chǎn)地。其中，來源于廣西博白和云南馬關的姜黃根莖采于2009年，來源于廣西金秀的姜黃根莖采于2010年，來源于其他產(chǎn)地的姜黃根莖均分別采集于2009年和2010年。采集的姜黃根莖由中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所楊志玲副研究員鑒定。產(chǎn)地氣候條件數(shù)據(jù)來源于中國自然資源數(shù)據(jù)庫，采集地自然概況見表1和表2。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制 分別取BDMC、DMC和Cur標準品適量，精密稱定后加無水乙醇配制成質量濃度200 mg·L-1的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用無水乙醇配制成質量濃度分別為0.000、4.000、8.000、12.000、16.000、20.000和40.000 μg·L-1的對照品溶液。使用W2695(Alliance系統(tǒng))高效液相色譜儀(美國Waters公司)進行HPLC分析。色譜條件參照文獻［9］。分別精密吸取不同質量濃度的對照品溶液5μL進樣，于波長430 nm處檢測。以對照品溶液的質量濃度為自變量x、峰面積為因變量y，繪制標準曲線。BDMC的線性回歸方程為：y1= 13 060x1-4 391.3，r=0.999 1；DMC的線性回歸方程為：y2=45 946x2-16 358，r=0.999 6；Cur的線性回歸方程為：y3=28 472x3-9 583.2，r=0.999 5。各標準品的線性范圍均為0～40μg·mL-1。

表1 姜黃采樣地的地理坐標和海拔Table 1 Geographic coordinate and altitude of sample plots of Curcuma longa L.

表2 姜黃產(chǎn)地的氣候概況Table 2 Climatic status of locations of Curcuma longa L.

1.2.2 樣品溶液制備及測定 姜黃根莖于60℃低溫烘干，粉碎后過100目篩、備用。準確稱取粉末樣品0.2 g，每一采樣地稱取3份，分別加入甲醇50 mL，混勻后于70℃水浴加熱回流提取30 min，冷卻后過濾，濾液用甲醇定容至100 mL。分別取5 mL樣品溶液，于12 000 r·min-1離心10min，取上清液待測。按照標準曲線的測定方法進行HPLC分析，采用外標一點法［9］計算樣品中BDMC、DMC和Cur的含量。

1.2.3 方法學考察 精密吸取上述混合對照品溶液5μL，按照上述色譜條件進行HPLC分析，連續(xù)進樣6次。BDMC、DMC和Cur的RSD值分別為0.7％、0.7％和0.3％，表明儀器精密度良好。

分別精密稱取同一供試樣品溶液5μL，按照上述色譜條件于0、2、4、6、8、12和24 h進樣測定，BDMC、DMC和Cur的 RSD值分別為0.58％、0.76％ 和0.54％，表明供試樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

取同一產(chǎn)地姜黃樣品6份，分別按照樣品溶液的制備方法及上述色譜條件進行測定，BDMC、DMC和Cur的平均含量分別為0.98％、0.27％和1.31％，RSD值分別為2.00％、0.95％和1.38％，表明該方法重復性良好。

稱定BDMC、DMC和Cur含量已知的姜黃粉末樣品5份，精密加入一定量的對照品，按樣品溶液的制備方法及上述色譜條件進行測定。BDMC、DMC和Cur的平均回收率分別為95.8％、96.8％和97.1％，RSD值分別為1.7％、2.2％和1.8％。

1.2.4 姜黃根際土壤營養(yǎng)元素測定 分別按照中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標準LY/T 1238—1999［14］114-115、LY/T 1228—1999［14］75-78、LY/T 1232—1999［14］88-90、LY/T 1234—1999［14］96-98和LY/T 1237—1999［14］106-108測定土壤的pH值及土壤中全N、全P、全K和有機質的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS12.0軟件對不同產(chǎn)地姜黃中姜黃素類成分的含量進行方差分析，運用Canoco 4.5軟件對不同產(chǎn)地姜黃中姜黃素類成分含量與產(chǎn)地的地理-氣候、土壤因子進行典范對應分析。

2 結果和分析

2.1 不同產(chǎn)地姜黃根際土壤中養(yǎng)分含量的比較

不同產(chǎn)地姜黃根際土壤中有機質、全N、全P、全K含量以及土壤pH值的分析結果見表3。由表3可知：姜黃多生長在中性偏酸性的土壤中，土壤水肥性能良好，土壤養(yǎng)分含量高于李隆云等［15］劃分的適宜或較適宜于姜黃生長土壤的標準。

不同產(chǎn)地姜黃根際土壤的性質差異較明顯。有機質含量為14.03～32.79 g·kg-1，其中，廣西博白和玉林的土壤有機質含量均在32 g·kg-1以上，且顯著高于其他產(chǎn)地(P＜0.05)；廣東四會的土壤有機質含量最低，僅為14.03 g·kg-1。全N含量為0.39～0.92 g·kg-1，其中，廣西博白和玉林及廣東四會的土壤全N含量較高，四川崇州和犍為的土壤全N含量較低。全P含量為0.56～1.55 g·kg-1，其中，四川崇州和犍為的土壤全P含量較高，顯著高于其他產(chǎn)地；而廣東四會的土壤全P含量最低。全K含量為2.29～9.23 g·kg-1，其中，四川崇州的土壤全K含量最高，且顯著高于其他產(chǎn)地；廣西玉林和云南馬關的土壤全K含量較低，并顯著低于其他產(chǎn)地。

2.2 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量的比較

姜黃素類成分含量是姜黃質量的主要評價指標。

對不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分的含量進行分析，結果見表4。

表3 不同產(chǎn)地姜黃根際土壤養(yǎng)分因子的比較(±SD)1)Table 3 Com parison of nutrient factors in rhizosphere soil of different locations of Curcuma longa L.(±SD)1)

表3 不同產(chǎn)地姜黃根際土壤養(yǎng)分因子的比較(±SD)1)Table 3 Com parison of nutrient factors in rhizosphere soil of different locations of Curcuma longa L.(±SD)1)

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

產(chǎn)地Location pH值pH value含量/g·kg-1 Content有機質 Organicmatter 全N TN 全P TP 全K TK四川崇州Chongzhou of Sichuan 7.40±0.20a 21.56±1.82b c 0.39±0.07b 1.49±0.10a 9.23±0.42a四川犍為Qianwei of Sichuan 6.67±0.16b 23.94±3.49b 0.46±0.13b 1.55±0.17a 7.49±0.34b廣東四會Sihui of Guangdong 5.84±0.11c 14.03±0.93d 0.79±0.16a 0.56±0.13c 4.05±0.89c廣西玉林Yulin of Guangxi 7.55±0.13a 32.67±3.76a 0.80±0.17a 0.95±0.22b 2.29±0.25d廣西博白Bobai of Guangxi 5.47±0.28d 32.79±7.59a 0.92±0.12a 0.78±0.11bc 4.42±0.41c廣西金秀Jinxiu of Guangxi 5.83±0.19c 17.80±2.04cd 0.65±0.14ab 0.86±0.13bc 4.14±0.27c云南馬關Maguan of Yunnan 5.26±0.04d 22.85±1.59bc 0.67±0.06ab 0.73±0.03bc 2.91±0.23d平均Average 6.29 23.66 0.67 0.99 4.93

表4 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量的比較(±SD)1)Table 4 Com parison of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locations(±SD)1)

表4 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量的比較(±SD)1)Table 4 Com parison of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locations(±SD)1)

1)Cur：姜黃素Curcumin；DMC：去甲氧基姜黃素Demethoxycurcumin；BDMC：雙去甲氧基姜黃素Bisdemethoxycurcumin.同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

產(chǎn)地Location含量/％ Content Cur DMC BDMC Total四川崇州Chongzhou of Sichuan 1.08±0.08d 0.20±0.03d 0.76±0.05b 2.04±0.15d四川犍為Qianwei of Sichuan 1.31±0.08c 0.27±0.04c 0.98±0.08a 2.56±0.13c廣東四會Sihui of Guangdong 0.91±0.06e 0.20±0.03d 0.62±0.00c 1.73±0.06e廣西玉林Yulin of Guangxi 2.26±0.07b 0.64±0.08b 0.45±0.05d 3.33±0.12b廣西博白Bobai of Guangxi 2.93±0.04a 1.08±0.05a 0.27±0.05e 4.29±0.06a廣西金秀Jinxiu of Guangxi 1.11±0.07d 0.26±0.03c 0.63±0.06c 2.00±0.16d云南馬關Maguan of Yunnan 1.11±0.07d 0.28±0.01c 0.96±0.00a 2.35±0.11c平均Average 1.53 0.42 0.67 2.61

由表4可知：不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素(Cur)的平均含量為1.53％。其中，產(chǎn)自廣西博白的樣品中Cur的平均含量最高，達到2.93％，顯著高于其他產(chǎn)地(P＜0.05)，但該產(chǎn)地的供試樣品僅為2010年采集；來源于廣西玉林的2009年采集的樣品中Cur含量為3.07％，而2010年采集的樣品中Cur含量僅為1.45％，變異較大；來源于廣東四會的樣品中Cur含量最低，僅為0.91％，顯著低于其他產(chǎn)地。

不同產(chǎn)地姜黃根莖中去甲氧基姜黃素(DMC)的平均含量為0.42％。其中，產(chǎn)自廣西博白的樣品中DMC含量最高(1.08％)，顯著高于其他產(chǎn)地；產(chǎn)自廣西玉林的樣品中DMC含量也較高(0.64％)；而來源于四川崇州和廣東四會的樣品中DMC含量最低(0.20％)。

不同產(chǎn)地姜黃根莖中雙去甲氧基姜黃素(BDMC)的平均含量為0.67％。其中，來源于四川犍為和云南馬關的樣品中BDMC含量較高，顯著高于其他產(chǎn)地；而來源于廣西博白的樣品中BDMC含量最低，僅為0.27％，顯著低于其他產(chǎn)地。

不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分的總含量平均為2.61％，以產(chǎn)自廣西博白的樣品最高，達到4.29％，顯著高于其他產(chǎn)地；來源于廣西玉林的2009年采集的樣品中姜黃素類成分的總含量為4.49％，而2010年采集的樣品僅為2.16％，說明該產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分的總含量存在不穩(wěn)定性；而來源于道地產(chǎn)地四川崇州和犍為的樣品中姜黃素類成分的總含量居中，2009年和2010年各成分含量極接近，質量較為穩(wěn)定；來源于廣東四會的樣品中姜黃素類成分的總含量最低，僅為1.73％，顯著低于其他產(chǎn)地。

2.3 環(huán)境因子對姜黃根莖中姜黃素類成分含量的影響

典范對應分析(CCA)是基于對應分析發(fā)展而來的一種排序方法，該方法將對應分析與多元回歸分析相結合，可直觀地給出多變量間的相互作用關系。對不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量-環(huán)境因子矩陣(包括地理-氣候因子及根際土壤養(yǎng)分因子)進行CCA排序，分析姜黃根莖中姜黃素類成分含量與環(huán)境因子的關系，結果見表5和表6；不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量與地理-氣候因子以及根際土壤養(yǎng)分因子的雙軸排序圖見圖1和圖2。

地理-氣候因子前2個排序軸的特征值分別占總特征值的96.4％和1.8％，姜黃根莖中姜黃素類成分含量與地理-氣候因子前2個排序軸的相關系數(shù)分別為0.999和0.961(表5)，姜黃根莖中姜黃素類成分含量的前2個排序軸的相關系數(shù)為0.005，地理-氣候因子前2個排序軸的相關系數(shù)為0.000。2個排序軸與地理-氣候因子的線性結合程度較好，反映了姜黃根莖中姜黃素類成分含量與地理-氣候因子間的關系，排序結果具有可靠性［16］。

由表5可以看出：年均氣溫和極端最低溫與第1排序軸呈極顯著正相關(P＜0.01)，緯度、年降水量、日照時數(shù)及無霜期與第1排序軸呈顯著正相關(P＜0.05)，而經(jīng)度和海拔與第1排序軸呈顯著負相關，極端最高溫與第1排序軸呈不顯著的正相關。海拔、年降水量及日照時數(shù)與第2排序軸呈正相關，而其他地理-氣候因子與第2排序軸均呈不顯著的負相關。

表5 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量與地理－氣候因子的CCA分析結果1)Table 5 Result of CCA analysis of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locations w ith geography-climate factors1)

表6 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量與根際土壤養(yǎng)分因子的CAA分析結果1)Table 6 Result of CCA analysis of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locations w ith nutrient factors in rhizosphere soil1)

根際土壤養(yǎng)分因子與前2個排序軸的特征值分別占總特征值的89.1％和1.8％，姜黃根莖中姜黃素類成分含量與根際土壤養(yǎng)分因子前2個排序軸的相關系數(shù)分別為0.944和0.828(表6)，姜黃根莖中姜黃素類成分含量的前2個排序軸的相關系數(shù)為0.008，根際土壤養(yǎng)分因子的前2個排序軸的相關系數(shù)為0.000。2個排序軸與根際土壤養(yǎng)分因子的線性結合程度較好，反應了姜黃根莖中姜黃素類成分含量與根際土壤養(yǎng)分因子間的關系，排序結果可靠［16］。

由表6可以看出：土壤有機質含量與第1排序軸呈極顯著正相關，土壤全N含量與第1排序軸呈不顯著的正相關，而土壤pH值、全P和全K含量與第1排序軸呈不顯著的負相關；土壤pH值與第2排序軸呈顯著正相關，土壤有機質、全P和全K含量與第2排序軸呈不顯著的正相關，而土壤全N含量與第2排序軸呈不顯著的負相關。

從圖1可以看出：第1排序軸與年均氣溫、極端最低溫的相關性較大，與第1排序軸顯著相關的因子有經(jīng)度、緯度、海拔、年降水量、無霜期和日照時數(shù)等；而第2排序軸與各地理-氣候因子均無顯著的相關關系。從圖2可以看出：第1排序軸與土壤有機質含量呈極顯著的正相關，第2排序軸與土壤pH值呈極顯著正相關。因此，基于第1排序軸特征貢獻率極高，年均氣溫和極端最低溫是影響姜黃根莖中姜黃素類成分含量的主要地理-氣候因子，而有機質含量是影響其含量的主要土壤養(yǎng)分因子。

3 討 論

圖1 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量與地理－氣候因子的雙軸排序圖Fig.1 Ordination biplot diagram of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locationswith geography-climate factors

圖2 不同產(chǎn)地姜黃根莖中姜黃素類成分含量與根際土壤養(yǎng)分因子的雙軸排序圖Fig.2 Ordination bip lot diagram of curcum inoids content in rhizome of Curcuma longa L.from different locationswith nutrient factors in rhizosphere soil

姜黃根莖中姜黃素類成分為多基因控制的數(shù)量性狀，極易受自然條件的影響。由于長期適應原產(chǎn)地的氣候特點，原產(chǎn)地不同的姜黃形成了各自固有的遺傳性(基因型)［17］。歷史上姜黃的道地產(chǎn)區(qū)在四川的崇州、雙流及犍為一帶，但本研究結果則顯示產(chǎn)自四川崇州和犍為的姜黃根莖中姜黃素類成分含量并不是最高，推測其原因可能是長期連作造成的種質退化或土壤地力衰竭。由文獻［10-13］可見：廣西產(chǎn)姜黃中有效成分含量的分析結果存在較大的差異，說明該產(chǎn)地姜黃中姜黃素類成分較不穩(wěn)定；而作者在本研究中對來源于廣西玉林采自2009年和2010年的姜黃根莖中姜黃素類成分含量進行了分析，也得出相似的結果。在廣西玉林，姜黃多為農(nóng)戶零星種植，缺少大面積、有規(guī)模的計劃種植，且姜黃栽培以種質保存為主要目的、姜黃生長的土壤條件存在較大差異，均導致姜黃類成分含量的不穩(wěn)定。

典范對應分析(CCA)將植物種類和樣方的排序與多個環(huán)境因子變量的作用以多元回歸的方式一一對應，使植物分布特性與環(huán)境因子的關系更為直觀地表現(xiàn)在排序圖中，目前這一方法不僅廣泛應用于生態(tài)學研究，在中藥資源生態(tài)學的研究中也得到一定的應用［18］。因而，作者應用CCA方法，對影響姜黃中姜黃素類成分含量的環(huán)境因子進行分析，結果表明：年均氣溫、極端最低溫和土壤有機質含量是影響姜黃根莖中姜黃素類化合物含量的主要環(huán)境因子。

次生代謝產(chǎn)物對生長環(huán)境的依賴性非常強，川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)適應冷涼的高海拔氣候，鱗莖中總生物堿含量隨氣溫的升高而降低［19］。澤瀉(Alisma plantago-aquatica L.)生長于溫和氣候環(huán)境中，在平均溫度18℃～24℃的條件下2，3-乙酰澤瀉醇含量最高［20］。姜黃長期生長在低海拔地區(qū)，適應炎熱的氣候條件，因此溫度成為其體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成的關鍵環(huán)境因子；姜黃素類成分含量與年均氣溫呈極顯著正相關，即隨氣溫的升高而增加。

大量研究結果表明：環(huán)境脅迫會造成植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量的變化，這種變化的誘導機制還不明確，但輕度脅迫能促進植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累。高溫和 K脅迫能導致蒼術〔Atractylodes lancea (Thunb.)DC.〕體內(nèi)蒼術素含量的增加［21］；而在整個生長過程中，輕度干旱脅迫可使蒼術根莖揮發(fā)油中5種主要成分的含量提高［22］。輕度水分脅迫能提高萬壽菊(Tagetes erecta L.)中酚類成分的含量［23］；遮陽處理對銀杏(Ginkgo biloba L.)槲皮素含量的提高有促進作用［24］；感染真菌病害后，苜蓿(Medicago sativa L.)體內(nèi)的異黃酮類成分顯著增加［25］。姜黃根莖中姜黃素類成分含量與極端最低溫呈極顯著正相關，低溫逆境的脅迫可能是造成其含量增加的重要因素。但若環(huán)境脅迫影響植物生長和存活時，植物則只能以生長為目的而相應減少次生代謝產(chǎn)物的合成［26］。

姜黃根莖中姜黃素類成分的含量與土壤中有機質含量呈極顯著正相關。土壤有機質是植物養(yǎng)分的主要來源，有機質含量可影響植物有效成分的含量［27-28］，因此，在保持土壤養(yǎng)分均衡的條件下，增施有機肥、改善土壤品質，對于確保藥材姜黃的品質具有重要意義。

致謝：本實驗室碩士研究生甘光標和舒梟參與了采樣工作，特此致謝!

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