肝纖維化分子機制及治療靶點研究進展

(中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198)

肝臟是體內(nèi)主要的代謝器官，具有強大的再生能力。肝損傷發(fā)生后肝臟通?？梢栽偕舸嬖陂L期損傷與慢性炎癥刺激，肝臟的再生能力將極大地被削弱，并引起纖維化發(fā)生。肝纖維化(liver fibrosis，LF)是慢性肝病進展至肝硬化(liver cirrhosis，LC)的關(guān)鍵步驟，它是一種機體代償修復(fù)反應(yīng)。多種病因如酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、病毒性肝炎、慢性膽汁淤積及自身免疫性肝炎都可發(fā)展為纖維化而進展至肝硬化和肝癌，給患者生命健康帶來嚴(yán)重威脅。探究肝纖維化發(fā)病的相關(guān)機制、尋找有效的預(yù)防及治療靶點，抑制疾病的進一步進展，對于維護肝纖維化患者的生命健康有極大的臨床意義。綜述肝纖維化發(fā)生過程中的相關(guān)分子機制及現(xiàn)階段研究的可能靶點，旨在為肝纖維化的治療提供研究依據(jù)。

1 肝纖維化發(fā)生的分子機制

1.1 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)水平上調(diào)

大量的研究表明，TGF-β在多種纖維化疾病的發(fā)生及進展過程中起重要作用[1]。在肝臟中，庫普弗細(xì)胞與肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是產(chǎn)生TGF-β的主要細(xì)胞。TGF-β在正常狀態(tài)下以非生物學(xué)活性形式存在，只有被加工后才能發(fā)揮作用，TGF-β可被αv整合素激活，促進肝臟纖維化[2]。在HSC中，TGF-β介導(dǎo)Smad2/3激活可促進I型和III型膠原的轉(zhuǎn)錄，從而使肝纖維化進一步發(fā)展。Smad信號傳導(dǎo)通路還促使Smad7轉(zhuǎn)錄，Smad7對TGF-β信號通路有負(fù)調(diào)節(jié)作用[1]。Ding等[3]研究證明，維生素D核受體(vitamin D receptor，VDR)在調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路中也有重要的作用。VDR激活后可以拮抗Smad與HSC中纖維化相關(guān)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合。因此，VDR缺乏促進了維生素D的治療作用，減輕了小鼠的肝纖維化。且有研究[4]表明，在脂質(zhì)生成過度的肝細(xì)胞中，TGF-β信號通路可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡，繼而激活HSC以促進肝纖維化。此外，TGF-β還可誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的結(jié)締組織生長因子，從而使得肝纖維化進展[5]。

1.2 炎癥因子浸潤

肝纖維化進展過程中，多種炎性細(xì)胞因子如IL-17、IL-22、IL-33及IL-13等發(fā)揮重要作用。IL-17是一種促炎及促纖維化的細(xì)胞因子，由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，在酒精性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎及自身免疫性肝炎中均有上調(diào)。IL-17產(chǎn)生后可激活庫普弗細(xì)胞與HSC中的NF-κB與STAT3信號通路。同時，HSC被激活后，胞內(nèi)膠原蛋白α1、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及TGF-β水平均被上調(diào)，這些因子都是纖維化發(fā)生過程中的標(biāo)志物[6]。除IL-17外，Th17細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-22。IL-22可通過STAT3通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、組織修復(fù)及代償反應(yīng)等多種細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)活動的發(fā)生[7]。在肝硬化患者中，IL-22表達被顯著上調(diào)，且IL-22水平與肝硬化進展程度、并發(fā)癥的發(fā)生率及肝硬化病死率等呈正相關(guān)[8]。除此之外，IL-33也是參與纖維化進展過程中重要的炎性因子[9]。在肝硬化患者中，IL-33及其受體水平升高；在CCl4誘導(dǎo)、TAA誘導(dǎo)及曼氏血吸蟲感染所引起的肝纖維化中，IL-33的表達均有所升高[9]。且IL-33被釋放出肝細(xì)胞后，可誘導(dǎo)Ⅱ型肝固有先天性淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生IL-13，進一步增強HSC中的TGF-β信號通路，促進纖維化發(fā)生及進展[9]。

1.3 Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)及腸道菌群

肝纖維化及肝硬化患者血漿與門靜脈內(nèi)毒素如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)增加，且有腸道滲漏及細(xì)菌過度生長與營養(yǎng)不良的狀況。因此，遷徙的腸道微生物及LPS的內(nèi)源性傳感器TLR4可能是促進肝纖維化進展的影響因素[10]。在Seki等[11]的研究中，與野生型小鼠相比，TLR4突變型小鼠及經(jīng)腸道滅菌小鼠均不會發(fā)展成肝纖維化，但纖維化過程中，TLR4突變型小鼠血液LPS水平與野生型小鼠水平一致，這表明TLR4主要發(fā)揮作用的地點是肝臟。活化的HSC表達TLR4，其配體可通過兩個不同的靶標(biāo)HSC和庫普弗細(xì)胞調(diào)節(jié)肝纖維化。TLR4和腸道菌群對于肝纖維化是必不可少的，并且TLR4下調(diào)靜態(tài)HSC上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和激活素膜結(jié)合抑制劑(一種TGF-β受體的誘餌受體)來增強HSC中的TGF-β信號，從而促進纖維化反應(yīng)[12]。TLR4信號傳導(dǎo)通路還通過抑制miRNA-29表達來調(diào)節(jié)HSC活化和肝纖維化[13]。

不同病因的肝臟疾病對于腸道微生物環(huán)境的影響各不相同，在由膽管結(jié)扎術(shù)引起的肝纖維化改變中，前期病變時腸道內(nèi)即存在細(xì)菌的過度生長，但腸道菌群的組成并未受到影響。而由慢性CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化僅在纖維化進展后期才影響腸細(xì)菌的組成[14]。單純的膽管結(jié)扎術(shù)不會引起營養(yǎng)不良，但是同時給予高脂飲食則會顯著改變膽管結(jié)扎術(shù)后腸道細(xì)菌的組成(革蘭氏陽性菌比例增加以及擬桿菌和硬生菌比例降低)。與基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的對照組小鼠相比，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠誘導(dǎo)的肝纖維化增加[15]。Dapito等[16]進一步從高脂飲食聯(lián)合膽管結(jié)扎術(shù)小鼠中純化了“纖維化”革蘭氏陰性細(xì)菌，并證實這些“纖維化”細(xì)菌顯著增強了肝纖維化，在由肝纖維化進展至肝癌的動物模型(DEN + CCl4)中，TLR4突變小鼠與野生型的腸道微生物組組成相似，這表明TLR4并不參與慢性肝損傷期間在腸道營養(yǎng)不良的發(fā)生。然而，一項關(guān)于使用無菌動物進行肝纖維化的研究[17]表明，無菌小鼠更易受到肝毒素誘導(dǎo)的肝纖維化的影響，這表明，在肝纖維化進展過程中，腸道內(nèi)除了有害細(xì)菌的增加外，還存在有益于防止肝纖維化的細(xì)菌。

1.4 HSC衰老

發(fā)生肝纖維化及肝硬化的肝臟中常存在衰老的HSC。與具有增殖能力的HSC相比，衰老的HSC喪失了增殖能力及產(chǎn)生膠原蛋白的能力，細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生增多，產(chǎn)生較多的炎癥因子[18]。p53是衰老相關(guān)基因，缺乏p53基因的小鼠體內(nèi)分離出的HSC較野生型小鼠的HSC有更強的增殖能力，且比野生型小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重纖維化作用，表明由p53介導(dǎo)的衰老的發(fā)生抑制了體內(nèi)纖維化的發(fā)展[19]。Lujambio等[20]研究則表明，在衰老的HSC中，p53的表達與肝巨噬細(xì)胞的M1態(tài)相關(guān)。M1態(tài)是一種肝巨噬細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的極化態(tài)，該狀態(tài)下，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)展被抑制。該研究還證實了p53-/-的HSC能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M2型，可通過干擾腫瘤微環(huán)境促進癌細(xì)胞增殖。但Dapito等[16]的研究中，肝巨噬細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型可以促進由肥胖導(dǎo)致的HCC，且由肥胖介導(dǎo)的HSC衰老與肝纖維化無關(guān)。因此，HSC的衰老在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍有爭議，需要在今后研究中進一步探究。

1.5 自噬

在活化的HSC中可觀察到自噬的發(fā)生，抑制自噬作用可抑制HSC的活化及增殖[21]。若小鼠體內(nèi)的HSC的自噬作用被抑制，HSC的活化及纖維化均減少。且由于自噬與脂質(zhì)降解相關(guān)，HSC自噬減少會導(dǎo)致細(xì)胞難以降解脂滴且處于靜止?fàn)顟B(tài)，這表明自噬是HSC活化的必要條件[21]。α1型抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin，α1-AT)缺乏癥是一種常見的遺傳性疾病，該病的發(fā)生主要由于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積了大量突變的Z蛋白。α1-AT Z蛋白突變的小鼠可表現(xiàn)出人類α1-AT缺乏癥的許多典型特征，如肝纖維化[22]。在α1-AT缺乏癥的患者體內(nèi)及Z蛋白突變的小鼠體內(nèi)，普遍可以觀察到肝細(xì)胞的自噬作用，自噬囊泡中包含有α1-AT突變的Z蛋白。且給予卡馬西平或雷帕霉素可抑制α1-AT突變的Z蛋白在肝臟中積累和肝纖維化的發(fā)生[22-23]。因此，自噬是HSC激活所必需的，肝細(xì)胞中的自噬作用與許多肝臟疾病(例如α1-AT缺乏癥、ALD和NASH)的發(fā)生具有相關(guān)性。

2 肝纖維化治療

2.1 肝纖維化的可逆轉(zhuǎn)性

在嚙齒動物及人肝臟晚期肝纖維化的早期階段，若消除了慢性炎癥或慢性損傷的主要誘因，肝臟可逆轉(zhuǎn)至正常功能，這一結(jié)論已經(jīng)在多個研究中證實[24-25]。這些改變包括以降低體質(zhì)量為目的調(diào)整NASH患者的生活方式，長期干擾及抑制或殺死慢性丙型肝炎及慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的病毒等。晚期肝纖維化及肝硬化的可逆轉(zhuǎn)性這一結(jié)論最重要的臨床價值在于其可以防止肝臟失代償?shù)陌l(fā)生，但這種可逆轉(zhuǎn)性并不能消除肝癌進展的風(fēng)險[26]。一旦消除了肝臟疾病和纖維化刺激的主要誘因，疾病的進展不僅會停滯，而且伴隨著纖維溶解的發(fā)生，代償性的肝硬化可逆轉(zhuǎn)至正常功能的肝臟。但是在接受抗病毒治療的患者中，有15%～25%并未顯示出肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，甚至?xí)^續(xù)進展，這表明依靠改變或控制誘因促使自發(fā)逆轉(zhuǎn)的過程是緩慢的，且無法預(yù)防危及生命的并發(fā)癥[27]。

2.2 肝纖維化治療靶標(biāo)

2.2.1 膠原蛋白合成

許多細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子既可以作為治療纖維化的指標(biāo)又可以作為治療靶點[28]。膠原蛋白是纖維化發(fā)生時最豐富的ECM蛋白，占肝硬化肝干重的50%[29]。其中，I、III和V型膠原蛋白的復(fù)合原纖維來自中央結(jié)構(gòu)，其他膠原蛋白、非膠原糖蛋白和蛋白聚糖直接或間接附著于中央結(jié)構(gòu)，從而為細(xì)胞提供錨固作用并維持器官結(jié)構(gòu)和體內(nèi)平衡[29]。所有ECM分子不僅可以作為細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)框架，而且還可以作為完整的超分子結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。慢性疾病和炎癥中，纖維形成和纖維分解過程的平衡紊亂最終導(dǎo)致肝臟單向性和持續(xù)性修復(fù)，即用功能失調(diào)的組織填充功能缺損的瘢痕組織，該過程由與纖維化發(fā)生相關(guān)的“不良膠原蛋白”主導(dǎo)發(fā)生[29]。但最近的研究還未探究清楚僅抑制I型膠原(最豐富的瘢痕膠原)的合成是有益還是有害的，因為這種抑制可能導(dǎo)致器官功能障礙并可能促進腫瘤的生長。通過在脂質(zhì)復(fù)合物中使用優(yōu)化的前膠原α1-Col1a1 siRNA，可以實現(xiàn)特異性的抑制體內(nèi)I型膠原蛋白的合成。這些脂質(zhì)復(fù)合物的應(yīng)用可使膽汁淤積性肝纖維化的小鼠模型中90%的Col1a1合成抑制，晚期肝纖維化開始治療時，肝臟中總膠原積累減少50%。研究結(jié)果[30]表明，此過程沒有肝臟炎癥增加，且肝臟中促炎細(xì)胞數(shù)量減少。在敲除Col1a1基因的小鼠中，證實Col1a1是肝纖維化的有效靶標(biāo)，其抗纖維化作用與脂質(zhì)復(fù)合物誘導(dǎo)的治療相似，抑制的I型膠原合成具有良好的抗炎作用[31]。最近的一項針對10例纖維化NASH患者的1期臨床試驗結(jié)果表明，應(yīng)用膠原蛋白特異性抗纖維化治療具有一定的效果，且短期內(nèi)的安全性可以保證[32]。以纖維化形成中起關(guān)鍵作用的其他膠原蛋白和ECM分子做為靶標(biāo)的研究才處于起步狀態(tài)。

2.2.2 纖維化發(fā)生相關(guān)分子

IL-30可通過誘導(dǎo)活化的HSC及NK細(xì)胞的胞膜活化性受體NKG2D來減緩肝臟纖維化，IL-30可促進肝NKT細(xì)胞表面NKG2D表達，從而增強其對活化的HSC的細(xì)胞毒活性作用，從而抑制肝纖維化[33]。因此，這可以作為一種治療肝纖維化的理想療法。而Kim-Kaneyama等[34]研究中，過氧化氫誘導(dǎo)的Clone 5(hydrogen peroxide-inducible clone-5，Hic-5)是一種TGF-β1誘導(dǎo)的黏著斑蛋白，Hic-5可促進細(xì)胞在各種器官中的增殖和ECM的擴增，且有助于血管的恢復(fù)和重構(gòu)。然而，最近的一項研究表明，在人和小鼠活化的HSC中，Hic-5可通過下調(diào)Smad7來增強TGF-β誘導(dǎo)的Smad2磷酸化，從而在減輕纖維化中起關(guān)鍵作用[35]。這些數(shù)據(jù)表明Hic-5是一種新型治療靶標(biāo)，也是活化HSC的潛在標(biāo)志物。此外，酰基輔酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(acetyl-coenzyme A acetyltransferase，ACAT)由兩種同工酶ACAT1和ACAT2組成，在游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯過程中起催化作用。游離膽固醇積累可通過促進TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)HSC活化和肝纖維化的發(fā)展。由于ACAT1在調(diào)節(jié)HSC中的游離膽固醇積累中起著至關(guān)重要的作用[36]，因此現(xiàn)階段研究集中在開發(fā)針對肝纖維化的ACAT1參與的治療性干預(yù)措施。

2.2.3 肝纖維化發(fā)生相關(guān)細(xì)胞

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與活化的HSC之間的相互作用來調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒依賴性肝纖維化[37]。Treg細(xì)胞以細(xì)胞接觸依賴性的方式通過分泌可溶性IL-8和/或TGF-β1來降低NK細(xì)胞對HSC的生物學(xué)作用，并下調(diào)HSC內(nèi)重要的NKT活化配體[38]。由其他病因引起的纖維化中可能也存在這種機制，但需要進一步的研究來證實。

巨噬細(xì)胞可分為M1型巨噬細(xì)胞(屬于經(jīng)典活化型)和M2型巨噬細(xì)胞(屬于另類活化型)，它們在肝纖維化的進展和消退中起著雙重作用[39]。通常，M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，而M2型巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和組織修復(fù)。M1和M2型巨噬細(xì)胞的失衡介導(dǎo)了肝纖維化的進展和消退[40]。在肝損傷的早期階段，骨髓來源的單核細(xì)胞被廣泛募集到肝臟，然后分化為炎性巨噬細(xì)胞(主要是M1型巨噬細(xì)胞)以產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和促纖維化細(xì)胞因子，從而促進炎癥反應(yīng)和HSC活化。之后，募集的巨噬細(xì)胞(主要是M2型巨噬細(xì)胞)轉(zhuǎn)換為分泌MMPs(降解ECM的主要酶)的表型，以修復(fù)纖維化[39,41-42]。

在先天免疫細(xì)胞中，肝巨噬細(xì)胞在纖維化的形成和纖維溶解中均起關(guān)鍵作用[43]。而再次受到損傷后，肝庫普弗細(xì)胞通過募集其他先天免疫細(xì)胞來啟動纖維化反應(yīng)，這些浸潤細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，許多因子可直接有效地促進HSC的炎癥及纖維化發(fā)生[44]。巨噬細(xì)胞因其纖溶特性，可以作為原發(fā)性損傷被抑制的逆轉(zhuǎn)過程中的治療方向，即以巨噬細(xì)胞為目標(biāo)，以趨化因子受體抗體或巨噬細(xì)胞活化受體為治療靶標(biāo)來預(yù)防纖維化相關(guān)因子的流入及活化可能是一種有效的肝纖維化治療策略。但這些療法盡在進展過程中有效，而無法解決纖維化的逆轉(zhuǎn)過程，有可能的原因是需要尋找到有纖溶作用的纖溶巨噬細(xì)胞。因此，若以肝纖維化的可逆轉(zhuǎn)性為治療方向，需要尋找在纖維化進展及消退期間均誘導(dǎo)或促進從促纖維化巨噬細(xì)胞向纖溶巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變的靶標(biāo)和療法。

3 問題與展望

在過去的十年內(nèi)，人們對肝纖維化的認(rèn)知取得了極大的進步。作為一種動態(tài)的過程，肝纖維化主要發(fā)生在各種慢性肝損傷導(dǎo)致的ECM及瘢痕組織的積累過程中，可由多種慢性肝損傷相關(guān)的病因引起，其發(fā)生不僅影響患者生活質(zhì)量，也給患者及其家庭帶來較大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此肝纖維化的預(yù)防及治療有重要的臨床意義。本綜述概括了肝纖維化發(fā)生過程中所涉及的主要分子機制及相關(guān)治療靶點，但盡管研究人員對于纖維化發(fā)病機理的認(rèn)識取得巨大進步，很多基本問題包括肝臟為何再生、纖維化與再生功能受損有何聯(lián)系、纖維化是如何進展至肝癌等問題尚待解決，現(xiàn)階段研究還主要集中在臨床前階段，很難發(fā)現(xiàn)針對各種病因引起的肝臟纖維化的通用療法。將肝纖維化細(xì)胞及分子基礎(chǔ)研究的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床的治療方案，獲得更多的臨床數(shù)據(jù)，是未來研究人員繼續(xù)努力的方向。