酸性染料比色法定量檢測荷葉總生物堿

鄧燕莉羅金波黃 甜張 玥肖文軍，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源工程系，湖南 長沙 410128）

酸性染料比色法定量檢測荷葉總生物堿

鄧燕莉1羅金波1黃 甜1張 玥1肖文軍1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源工程系，湖南 長沙 410128）

采用均勻設(shè)計法，從荷葉生物堿的萃取振蕩時間及萃取靜置時間的篩選出發(fā)，通過對鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液pH值、體積以及溴甲酚綠體積等因子的研究，發(fā)現(xiàn)荷葉總生物堿在酸性染料比色法中的最大吸收波長為416nm，萃取振蕩時間為60s，萃取靜置時間為150min；最佳測定條件為緩沖液pH值2.0，緩沖液體積0.5mL，溴甲酚綠溶液體積1.0mL。同時，得回歸方程y＝14.12x－0.013，R2＝0.999 8（n＝5），平均回收率達(dá)98.35%，RSD 為 2.11%。驗證實驗表明，該方法線性關(guān)系良好，重復(fù)性好，可推廣應(yīng)用。與當(dāng)前檢測方法相比相對簡單、快捷、準(zhǔn)確。

總生物堿；酸性染料比色法；荷葉；檢測

荷葉是睡蓮科蓮屬植物的葉［1］。近年來，對荷葉化學(xué)成分的分離工程和藥理活性的研究［2］表明，荷葉主要生物活性物質(zhì)為生物堿。研究［3－5］表明，荷葉生物堿類化合物主要是荷葉堿、O－去甲基荷葉堿、蓮堿、去氫蓮堿、去氫荷葉堿等，此類化合物具有顯著的降脂減肥、抗病毒、抑菌、抗驚厥等藥理作用。目前測定荷葉生物堿含量的方法［6］主要有薄層掃描法、高效液相色譜法和紫外分光光度法3種。薄層掃描法［7］和高效液相色譜法［8，9］雖然對荷葉生物堿測定的結(jié)果比較精確，但只能測定單一成分的含量，且所需儀器設(shè)備昂貴，操作繁瑣，大多在科研單位實驗室使用，不適宜推廣；采用紫外分光光度法［10，11］測定荷葉中的生物堿含量，操作簡單、快速、準(zhǔn)確，而且所需儀器設(shè)備造價不高。

在紫外分光光度法基礎(chǔ)上改進(jìn)的酸性染料比色法近年來應(yīng)用較多［12］，常用其測定總生物堿的含量，靈敏度高，在測定小劑量或樣品量較少時有優(yōu)勢，專屬性較好；結(jié)果較為準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡便［13－16］；其不足之處在于對試驗條件要求較嚴(yán)格，試驗操作和條件的穩(wěn)定性對測定結(jié)果影響較大。本試驗擬建立酸性染料比色法定量檢測荷葉中總生物堿含量的方法，以期建立一種準(zhǔn)確、快速檢測荷葉總生物堿的含量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

荷葉：由湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司提供。用微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎后，再用聚乙烯和聚氯乙烯復(fù)合膜袋密閉包裝，置于干燥器中貯藏，備用。

1.1.2 主要試劑

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品：批號111566－200402，中國藥品生物檢定所；

氯仿、乙醇、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀：均為分析純。

1.1.3 試驗儀器

微型植物試樣粉碎機(jī)：FZ102型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：BSA－124S型，德國Sartorius賽多利斯集團(tuán)；

恒溫水浴鍋：DHW－600型，北京國華醫(yī)療器械廠；

電子調(diào)溫電熱套：98－I－C型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－2550，日本島津公司；

冷凍干燥機(jī)：AIPHR1－2LD，德國Christ公司；

超聲波清洗器：KQ－3200型，上海昆山市超聲儀器有限公司；

酸度計：PHS－25型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗所需溶液的配制

1.2.1 鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液 稱取鄰苯二甲酸氫鉀（110℃下干燥2h）5.10g，加適量的蒸餾水溶解，然后定容至500mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為4.0。

1.2.2 溴甲酚 綠溶液 稱取 溴甲酚 綠0.10g，加入7.15mL 0.02mol/L NaOH溶液溶解，蒸餾水定容至250mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 荷葉生物堿最大吸收波長的確定

（1）荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長：稱取4.15mg荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用氯仿溶解定容，以氯仿為空白，用紫外分光光度計在190～800nm下掃描，測得荷葉堿的紫外最大吸收波長。

（2）荷葉生物堿經(jīng)溴甲酚綠染色后的最大吸收波長：

①荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品染色后的最大吸收波長。精密稱取4.15mg荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用氯仿定容，混勻，吸取1mL于10mL分液漏斗中，加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1mL，溴甲酚綠溶液1mL，振蕩，加入5mL氯仿，振蕩30s，靜置30min。取下層氯仿液4mL，以標(biāo)準(zhǔn)品空白為對照，在紫外分光光度計的190～800nm下掃描，測得荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)溴甲酚綠染色后的最大吸收波長。

②樣品經(jīng)溴甲酚綠染色后的最大吸收波長。稱取荷葉2.0g，加入濃度為80%的乙醇80mL，于80℃ 的恒溫水浴回流提取。趁熱過濾，用80%乙醇定容至80mL，即為樣品液。吸取1mL樣品液于10mL分液漏斗中，揮去乙醇，加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1mL，溴甲酚綠溶液1mL，振蕩，加入5mL氯仿，振蕩30s，靜置30min。取下層氯仿液4mL，以未加樣品液的試劑空白為對照，在紫外分光光度計的190～800nm下掃描，測出樣品液經(jīng)溴甲酚綠染色后的最大吸收波長。

1.3.2 荷葉總生物堿萃取條件的優(yōu)化

（1）萃取振蕩時間篩選：參照1.3.1②方法，設(shè)計振蕩時間為30，60，90s，在已確定的最大吸收波長下比色，篩選最佳萃取振蕩時間。

（2）萃取靜置時間篩選：參照1.3.1②方法，在已確定的振蕩時間基礎(chǔ)上，設(shè)計靜置時間分別為30，60，90，120，150，180，210min，根據(jù)結(jié)果篩選出最佳靜置時間。

1.3.3 荷葉總生物堿含量測定方法的建立

（1）均勻設(shè)計試驗因素及水平的設(shè)定：根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，采用均勻設(shè)計U10（108）表，研究鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液pH值、體積及溴甲酚綠溶液體積3個主要因素的10個水平（見表1）對荷葉總生物堿含量測定的影響。

表1 均勻設(shè)計試驗因素及水平表Table 1 The factors and levers of uniform design

（2）測定方法條件的優(yōu)化：在試驗得出的較優(yōu)條件上，應(yīng)用均勻設(shè)計軟件對其進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳荷葉總生物堿的含量測定條件。

（3）驗證實驗：參照1.3.1②的方法，以試驗得出的最佳含量測定條件操作，對測定方法的重復(fù)性進(jìn)行考察。

（4）線性關(guān)系的考察：參照1.3.1①的方法，分別精密吸取荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25mL于5mL容量瓶中，氯仿定容，以試驗得出的最佳含量測定條件操作，以試劑空白為參比液，在最大吸收波長處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）加樣回收率的測定：稱取已知生物堿含量（0.85%）的同批荷葉2.0g，共5份，分別精密加入荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為0.415mg/mL）各1mL，分別加入濃度為80%乙醇80mL，在80℃下的恒溫水浴冷凝回流提取。趁熱過濾，用80%乙醇定容至80mL，即為樣品液。吸取1mL樣品液按最佳含量測定條件操作，計算生物堿含量，分析加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉生物堿最大吸收波長的確定

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品、經(jīng)溴甲酚綠染色后荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品及染色后的樣品液的全波長掃描圖分別見圖1～3。由圖1～3可知，荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外最大吸收波長為273nm，而經(jīng)溴甲酚綠染色后的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均在416nm處有最大吸收波長，故本試驗以416nm為含量測定的最大吸收波長。

圖1 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品全波長光譜圖Figure 1 The full spectrum of standard nuciferine

圖2 染色后荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品全波長光譜圖Figure 2 The full spectrum of tinct standard nuciferine

圖3 染色后荷葉堿樣品全波長光譜圖Figure 3 The full spectrum of tinct nuciferine sample

2.2 荷葉總生物堿萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取振蕩時間篩選 不同振蕩時間的萃取結(jié)果見表2。由表2可知，隨著振蕩時間的增加，萃取液的吸光度上升，但振蕩60s的吸光度最穩(wěn)定，RSD＝1.86%（n＝5）。所以試驗選擇萃取振蕩的時間為60s。

表2 振蕩時間對萃取液吸光度及穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of absorbence and stability on different surge time（n＝5）

2.2.2 萃取靜置時間篩選 靜置時間對萃取液吸光度及穩(wěn)定性的影響見表3。由表3可知，靜置時間在120～210min范圍內(nèi)時荷葉生物堿與溴甲酚綠形成的有機(jī)絡(luò)合物平均RSD為0.28%，穩(wěn)定性較好，故選擇靜置時間為150min。

表3 靜置時間對萃取液吸光度及穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of absorbence and stability on different stillness time

2.3 酸性染料比色法定量檢測荷葉生物堿的方法

2.3.1 均勻設(shè)計因素及水平的主次大小 酸性染料比色法定量檢測荷葉生物堿均勻設(shè)計試驗結(jié)果見表4。將試驗結(jié)果采用均勻設(shè)計軟件全回歸分析法，擬建立回歸方程，樣本容量N＝10，顯著性水平α＝0.05，得檢驗值Ft＝24.23，臨界值F（0.05，3，6）＝ 4.757，F(xiàn)t＞F（0.05，3，6），剩余標(biāo)準(zhǔn)差s＝6.92，回歸方程顯著。

表4 酸性染料比色法定量檢測荷葉生物堿均勻設(shè)計試驗結(jié)果Table 4 Results of determination of total alkaloid in lotus leaf byacid dye colorimetry application uniform design experiment

由試驗結(jié)果分析可知，在酸性染料比色法定量檢測荷葉總生物堿中，影響荷葉生物堿含量測定主次因素的大小依次為緩沖液pH值＞溴甲酚綠用量＞緩沖液用量。

2.3.2 荷葉總生物堿含量測定方法的優(yōu)化 根據(jù)試驗結(jié)果，應(yīng)用網(wǎng)格嘗試法對試驗進(jìn)行優(yōu)化，得緩沖液pH值為1.53，緩沖液體積為0.5mL，溴甲酚綠溶液體積為1.0mL。由于實驗室常用的緩沖液pH值通常不小于2.0，所以本試驗選定緩沖液的pH值為2.0。將已優(yōu)化的條件：緩沖液pH值2.0，緩沖液體積0.5mL，溴甲酚綠溶液體積1.0mL進(jìn)行微機(jī)分析，預(yù)報試驗結(jié)果表明理論上的吸光度可達(dá)0.692±0.080 4，充分達(dá)到含量測定的響應(yīng)要求。

2.3.3 含量測定優(yōu)化方法的驗證 按均勻設(shè)計試驗得到的最佳含量測定條件進(jìn)行驗證實驗。得到的實驗平均吸光度值為0.702，RSD值為1.58%（n＝5），處于2.3.2項中測定的置信區(qū)間［0.692±0.080 4］內(nèi)，證明優(yōu)選的含量測定條件是準(zhǔn)確可信的。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 不同濃度的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在416nm處的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，得回歸方程y＝14.12x－0.013，R2＝0.999 8（n＝5），表明荷葉堿在20～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 The standard curve of standard nuciferine

2.3.5 加樣回收率測定 樣品的加樣回收試驗結(jié)果見表5，可見本優(yōu)化工藝下的平均回收率達(dá)98.35%，RSD為2.11%，證明應(yīng)用酸性染料比色法定量檢測荷葉生物堿的方法科學(xué)可行。

表5 加樣回收率結(jié)果Table 5 The results of recovery with application of sample

3 結(jié)束語

在酸性染料比色法中，pH值是影響測定準(zhǔn)確性的最重要因素。只有選擇合適的pH值使生物堿能夠與氫離子完全結(jié)合成陽離子，才能保證定量測定。本試驗在選擇pH值時，以荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在pH值為4.0的條件下進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其在416nm處的吸光值低于0.2，靈敏度不高，這可能是由于pH值偏高，荷葉堿沒有完全形成陽離子的緣故。

在比色過程中，應(yīng)嚴(yán)禁水分混入有機(jī)溶劑中，因為：水相中有過量的有色染料，會影響測定結(jié)果；水的混入使有機(jī)溶劑混濁，影響比色，故必要時應(yīng)加入脫水劑（如無水硫酸鈉）或經(jīng)濾紙過濾除去。本試驗在測定荷葉生物堿時，為防止水分進(jìn)入氯仿層，僅取分液漏斗下層5mL有機(jī)相中的4mL進(jìn)行測定，有效的控制了水分對測定的影響。

本試驗所設(shè)計的方法與目前測定荷葉生物堿含量的方法［6－9］相比，回歸方程為y＝14.12x－0.013，R2＝0.999 8（n＝5），平均回收率達(dá)98.35%，RSD為2.11%，表明荷葉生物堿在20～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，具有嚴(yán)謹(jǐn)性，可推廣應(yīng)用。

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Definite determination of total alkaloids in lotus by acid dye colorimetry

DENG Yan－li1LUO Jin－bo1HUANG Tian1ZHANG Yue1XIAO Wen－jun1，2

（1.National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Plant Resource Engineering Department of Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128，China）

Several factors were studied including extraction time and standing time，pH value and dosage of the potassium acid phthalate buffer solution，volume of bromcresol green and so on factors by using uniform design method.The result showed that the maximum absorptive wavelength of total alkaloids of Lotus leaf was 416nm by acid dye colorimetry，extracting time was 60s，standing time was 150min.And the optimum conditions of definite determination of total alkaloids in Lotus were：pH value of buffer solution 2.0，volume of buffer solution 0.5mL，dosage of bromcresol green 1.0mL.Simultaneously，the regression equationy＝ 14.12x－0.013，R2＝0.999 8（n＝5），average recovery rate 98.35%，RSD 2.11%.The method has good linear relationship，reproducibility，and popularization and application.And the method was much easier，faster and more accurate.

total alkaloids；acid dye colorimetry；lotus leaf；detection

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.025

國家科技部APEC基金項目（編號：200602）；湖南省科技重點項目（編號：2005WK2002）

鄧燕莉（1985－），女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：dengyanli2011＠sina.com

肖文軍

2011－04－10