響應(yīng)面法優(yōu)化大黃附子藥對中蒽醌類成分的提取工藝

葉良紅，朱紅云, 李蕓霞

大黃附子相互配伍應(yīng)用首見于《金匱要略》大黃附子湯，是體現(xiàn)中醫(yī)用藥特色—中藥配伍的代表藥對之一。大黃苦寒攻下泄熱，附子辛熱散寒，寒熱并用，相反相成，首創(chuàng)溫下先河。主寒實內(nèi)結(jié)證。寒實內(nèi)結(jié)者，非溫不能散其寒，非下不能去其積。而方中大黃性苦寒，不宜用之，但得附子之辛熱，則大黃苦寒之性被制，而瀉下之用猶存，共奏溫下之功。附子、大黃是溫下的經(jīng)典藥對，治寒實證用大黃就是去性取用[1]。本實驗采用響應(yīng)曲面法對大黃附子藥對中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取工藝進行優(yōu)化，以便對該藥進行進一步研究。

1 儀器與材料

Varian-210高效液相色譜儀（瓦里安公司）；K Q5200E型超聲機 (昆山市超聲儀器有限公司)，頻率為40khz；大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110756-200110）；大黃酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110757-200206）；大黃素甲醚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110758-200912）；大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：A0046）；蘆薈大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110795-200806）。HPLC所用溶劑均為色譜純，所用水為樂百氏純凈水，論文中涉及的其他試劑均為分析純。大黃，附子購自同仁堂大藥房，揀選清洗，粉碎，過四號篩。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS C18柱 (250mm×4.6mm,5μm)；流動相為乙醇:1%冰醋酸水溶液(70:30，v/v); 流速為1.0mL.min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為20μL；測定波長為254nm。

2.2 標準溶液的制備

精密稱取大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，分別置于五個25mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，得對照品儲備液。取各儲備液適量配成一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品工作液。進樣測定，以濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)r2和線性范圍（見表1）。

表1 5種蒽醌類成分的回歸方程

2.3 精密度試驗

日內(nèi)精密吸取混合對照品溶液20μL,按HPLC條件，重復(fù)進樣6次，結(jié)果各峰保留時間的RSD均2%，峰面積的RSD均1.4%。

2.4 重復(fù)性試驗

按“2.2”項下方法平行制備配伍樣品溶液5份，按“2.1”項色譜條件測定含量進行分析，結(jié)果表明5個指標成分保留時間RSD均1.3%，峰面積的RSD均1.6%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取統(tǒng)一混合標準品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24h內(nèi)進樣分析，結(jié)果表明5個指標色譜峰保留時間的RSD均1.1%，峰面積均1.5%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加樣回收試驗

取已知含量的大黃藥材粉末0.5 g，附子藥材1 g，加入適量大黃蒽醌類對照品，計算得平均加樣回收率均在99.7%～100. 2%范圍，RSD均在0.99%～1.95%范圍。

2.7 含量測定

2.7.1 游離蒽醌的測定 根據(jù)參考文獻[2～6]取2mL的供試品溶液，加10mL蒸餾水混勻，再加入10mL乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯層，水層再用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯，揮干后殘渣加甲醇溶解在25mL容量瓶中，按“2.1”項色譜條件測定含量。

2.7.2 結(jié)合蒽醌的測定 取“2.7.1”項剩余水層加2.5 mol?L-1的硫酸溶液20mL和10mL乙酸乙酯溶液水浴2h，放至室溫，乙酸乙酯萃取3次，每次10mL，合并乙酸乙酯，揮干，殘渣用甲醇定容在10mL容量瓶中，按“2.1”項色譜條件測定含量。

2.8 單因素試驗

2.8.1 乙醇濃度對提取率的影響 根據(jù)參考文獻[7]取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入60%、70%、80%、90%、95%乙醇，50℃超聲提取3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著乙醇濃度的增加先上升再下降，且都在70%時為最高。結(jié)果見圖1、2。

圖1 乙醇濃度對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖2 乙醇濃度對游離蒽醌提取率的影響

2.8.2 料液比對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比5、8、10、12、15加入70%乙醇，50℃超聲3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著乙醇用量的增加先上升再下降，在10mL左右時提取率最高。結(jié)果見圖3、4。

圖3 液料比對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖4 液料比對游離蒽醌提取率的影響

2.8.3 超聲次數(shù)對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入70%乙醇，50 ℃超聲1、2、3、4、5次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著超聲次數(shù)的增加先上升，超聲3次時基本達到最高，再增加超聲次數(shù)，結(jié)合蒽醌的提取率無多大變化，游離蒽醌的提取率下降。結(jié)果見圖5、6。

圖5 超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌的提取率的影響

圖6 超聲次數(shù)對游離蒽醌提取率的影響

2.8.4 超聲溫度對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入70%乙醇，40℃、50℃、60℃、70℃、80℃超聲3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著溫度的增加先上升再下降，且都在50℃時為最高?？赡芘c濕熱效應(yīng)有關(guān)，溫度越高，一些敏感的蒽醌類成分可能會分解導(dǎo)致提取率變小。故溫度宜選擇50℃。結(jié)果見圖7、8。

圖7 超聲溫度對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖8 超聲溫度對游離蒽醌提取率的影響

2.8.5 超聲時間對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別分別按液料比10加入70%乙醇，50℃超聲3次，每次15、20、25、30、35min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著超聲時間的增加先上升，在超聲25min左右提取率最高。結(jié)果見圖9、10。

圖9 超聲時間對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖10 超聲時間對游離蒽醌提取綠的影響

所考察的因素中，對大黃游離和結(jié)合蒽醌的提取率的影響結(jié)果分析，選擇超聲次數(shù)，超聲時間和液料比做響應(yīng)面實驗，而溫度規(guī)定在50℃，乙醇濃度為70%。

2.9 響應(yīng)面設(shè)計實驗

2.9.1 實驗因素與水平設(shè)計 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件，以液料比、超聲次數(shù)、超聲時間為主要考查因素，分別用X1、X2、X3來表示，并以1、0、-1分別表示自變量的高低水平。分別以游離蒽醌、結(jié)合蒽醌的提取率為響應(yīng)值。設(shè)計的實驗因素和水平取值見表2。

表2 因素與水平

2.9.2 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果 分別以游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表3的結(jié)果，對其進行多元二次回歸分析如表4和表5。從回歸分析中可以看出一次項、二次項及交互項都有顯著影響。各實驗因子對響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系。實驗因子對響應(yīng)值的影響如下式：

表3 響應(yīng)面曲線設(shè)計表及實驗結(jié)果

表4 響應(yīng)曲面模型分析及方差分析（游離蒽醌）

表5 響應(yīng)曲面模型分析及方差分析（結(jié)合蒽醌）

A^2 0.2626 1 0.2626 2434.9972 < 0.0001 B^2 0.0912 1 0.0912 846.4437 < 0.0001 C^2 0.0793 1 0.0793 735.3806 < 0.0001 Residual 0.0008 7 0.0001 Lack of Fit 0.0005 3 0.0002 2.26190.2234 不顯著

由表4和表5所示，超聲時間、超聲次數(shù)、液料比及其二次項對兩種成分的提取率影響極顯著。交互項也達到了顯著水平。兩個模型的決定系數(shù)R2值均為0.999，經(jīng)擬合檢驗，p<0.0001差異極顯著，說明該方程能夠正確的反映提取量與超聲時間、超聲次數(shù)、液料比之間的關(guān)系。失擬檢驗p值分別為0.1531和0.2234，均大于0.05，說明本實驗可代替試驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。

通過響應(yīng)面分析得到實驗結(jié)果圖11～圖16，得到超聲提取大黃附子藥對中游離蒽醌的最佳條件為液料比10.31，提取次數(shù)3.53次，提取時間26.76min，在此條件下游離蒽醌的最佳提取量為11.629mg.g-1；結(jié)合蒽醌的最佳提取條件為液料比10.34，超聲次數(shù)3.42次，超聲時間24.25min，在此條件下的結(jié)合蒽醌的提取量為5.455mg.g-1。

圖11 溶劑用量和超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖12 溶劑用量和超聲時間對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖13 超聲時間和超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖14 超聲次數(shù)和液料比對游離 蒽醌提取率的響應(yīng)曲圖

圖15 超聲時間和液料比對游離蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖16 超聲時間和超聲次數(shù)對游離蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

為了驗證響應(yīng)面法的可靠性，采用最佳提取工藝條件進行5次平行超聲提取驗證試驗，試驗值與理論值相差0.87%和0.24%。因此通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲提取工藝條件參數(shù)是準確可靠，具有實用價值的。

3 討論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用試驗設(shè)計軟件Design Expert設(shè)計了三因素三水平的中心組合設(shè)計，并對大黃附子的提取工藝進行了優(yōu)化，建立了二次多項式的回歸模型，擬合度良好。對模型進行分析，得到了最適提取工藝參數(shù)。游離蒽醌的最佳條件為液料比10.31，提取次數(shù)3.53次，提取時間26.76min。結(jié)合蒽醌的最佳提取條件為液料比10.34，超聲次數(shù)3.42次，超聲時間24.25min。驗證實驗表明所有優(yōu)選出來的條件穩(wěn)定性好，重復(fù)性高。本實驗優(yōu)選出來的實驗條件對大黃附子藥對中蒽醌類成分的進一步研究有指導(dǎo)意義。

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