肝組織中 NF-κB、TGF-β1及其 Ⅰ型受體 mRNA和 HSC在肝纖維化中的改變及護(hù)肝片對(duì)其的影響

吳義春 吳 強(qiáng) 楊 雁 楊 楓 陳敏珠

肝組織中 NF-κB、TGF-β1及其 Ⅰ型受體 mRNA和 HSC在肝纖維化中的改變及護(hù)肝片對(duì)其的影響

吳義春＊吳 強(qiáng)＊1楊 雁1楊 楓1陳敏珠1

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室合肥230601;1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室合肥230022)

目的 探討中、晚期纖維化大鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化與增殖、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受體(TβRⅠ)表達(dá)的改變及護(hù)肝片對(duì)其的影響。方法 采用12.5%CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,自造模之日起,大鼠分組灌胃給藥(護(hù)肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分別處死動(dòng)物,取左葉肝組織石蠟包埋,制作組織芯片。免疫組化S-P法檢測(cè)大鼠肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和NF-κB p65蛋白的表達(dá),原位雜交檢測(cè) TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá);并用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),對(duì)NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果 1.模型復(fù)制8周和13周,模型組的肝損傷及其纖維化分級(jí)均明顯高于正常組(P<0.01),護(hù)肝片組的肝損傷及其纖維化分級(jí)均輕于模型組。2.模型復(fù)制8周和13周,模型組活化的 HSC(即α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞)數(shù)量較正常組明顯增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)均較正常組明顯增強(qiáng)(P<0.01);3.護(hù)肝片顯著抑制8、13周纖維化肝組織 HSC的活化與增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 抑制 HSC的活化與增殖和NF-κB p65蛋白與 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)可能是護(hù)肝片抗肝纖維化作用的靶點(diǎn)之一。

肝纖維化; 護(hù)肝片; 肝星狀細(xì)胞; 核轉(zhuǎn)錄因子-κB; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βRⅠ;免疫組化; 原位雜交; 組織芯片

肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時(shí)的一種修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段,其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與降解失衡,導(dǎo)致ECM在竇周間隙的大量沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纖維化時(shí)ECM過多產(chǎn)生和沉積的主要細(xì)胞來(lái)源,HSC的激活、增殖及 ECM的過量沉積在肝纖維化過程中起核心作用[1,2]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì),普遍存在于多種組織的多種細(xì)胞中。體外研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可能參與調(diào)控了肝纖維化過程中的枯否氏細(xì)胞(Kupffer cells,KC)和肝星狀細(xì)胞的活化[3-4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是強(qiáng)有力的致纖維化的細(xì)胞因子,促進(jìn)HSC增殖活化,在纖維化進(jìn)程中起重要作用[5]。護(hù)肝片抑制纖維化肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ蛋白的表達(dá)[2],為此,本研究擬就護(hù)肝片對(duì)中晚期纖維化大鼠肝組織 HSC與 NF-κB、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)的影響進(jìn)行觀察,進(jìn)一步探討其抗肝纖維化作用機(jī)制。

材料和方法

1.動(dòng)物模型的建立和肝組織的處理

SD大鼠54只,雌雄兼用,體重150-180g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(清潔級(jí)),標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。隨機(jī)分成兩大組:模型復(fù)制8與13周,均各設(shè)正常組、模型組和護(hù)肝片(921mg/kg)組。自模型復(fù)制之日起,除正常組外,各組大鼠按100g體重0.5ml背部皮下注射10﹪CCl4精制花生油溶液,每周2次[6],分別連續(xù)8與13周。灌胃(ig)給藥,每天1次,正常組與模型組ig等容量5g/l羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,直至8周或13周。分別在實(shí)驗(yàn)的第8、13周末處死動(dòng)物,取左葉肝組織常規(guī)10﹪甲醛溶液固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,HE染色,光鏡觀察。

2.組織芯片制作

HE染色切片在光鏡下用定位器定位后,通過打孔、定位、取樣、點(diǎn)樣,從供體蠟塊中的相應(yīng)部位采集目標(biāo)組織整齊包埋于受體蠟塊中,制成組織片直徑為1mm、間隔1mm的組織芯片。4μm連續(xù)切片,貼附于經(jīng)10﹪多聚賴氨酸防脫片預(yù)處理的載玻片上,分別作蘇木精-伊紅(HE)染色、網(wǎng)狀纖維染色、Van Gieson(V G)膠原纖維染色、免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交。

3.免疫組化 S-P法檢測(cè)α-SMA、NF-κB蛋白的表達(dá)

采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù),S-P法免疫組織化學(xué)染色,用DAB/H202顯色,蘇木精復(fù)染。羊抗Actin(Ⅰ-19)、兔抗 NF-κB p65多克隆抗體均購(gòu)于Santa Cruz,兔S-P法(Second Generation LABSA)Kits試劑盒為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品。具體操作遵試劑盒說(shuō)明書,用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

4.原位雜交檢測(cè) TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的表達(dá)

TGF-β1及 TβRⅠ的寡核苷酸探針均經(jīng)地高辛標(biāo)記,顯色系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(SABC),DAB顯色。針對(duì)TGF-β1靶基因的 mRNA 的探針序列為:(1)5′-ACCTG CAA GA CTA TC GACA T GGA GC TGGTG-3′;(2)5′-TGTAC AACA G CACCC GCGAC CGGGT GGCCG-3′;(3)5′-GTACC A GAAA TACA G CAACA A TTCC TGGCG-3′。針對(duì) TβRⅠ靶基因的 mRNA的探針序列為:(1)5′-TA GCT GAAA T TGACT TAA TT CCTCG A GA TA-3′;(2)5′-GTGTC A GA TT A TCA T GA GCA TGGA T CCCTT-3′;(3)5′-GTA TGCCAA T GGA GC A GCTA GGCTT ACA GC-3′。TGF-β1及 TβR Ⅰ的原位雜交檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。具體操作遵試劑盒說(shuō)明書,用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用預(yù)雜交液代替雜交液作陰性對(duì)照。

5.定量分析

肝纖維化病理學(xué)分級(jí)為0-Ⅵ級(jí)[7]。α-SMA免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性,200倍光鏡下任選3個(gè)250μm×250μm范圍計(jì)數(shù)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)判斷結(jié)果。NF-κB以細(xì)胞漿和∕或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性;TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的原位雜交染色結(jié)果,以胞漿內(nèi)或胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。Eclip se E800型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)(×400)下任選取3個(gè)視野用Spot Advanced顯微攝像系統(tǒng)(美國(guó)Diagnostic Instruments Inc)拍攝照片,用 4.01版MetaMorp h圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Universal Imaging公司)進(jìn)行顯微定量分析,分析每個(gè)組織片上NF-κB 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的平均灰度值(Average gray value,A GV)和平均光密度值(Mean optical density,MOD)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS(11.0 for windows)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料間比較采用t檢驗(yàn)和one way ANOVA檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.護(hù)肝片對(duì)CCl4性纖維化大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響

HE、網(wǎng)狀纖維及V G膠原纖維染色結(jié)果見表1。正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn),模型組大鼠在模型復(fù)制8、13周均可見肝細(xì)胞脂肪變性、水變性和點(diǎn)狀壞死、碎片狀壞死,13周時(shí)膠原纖維增生形成完整的纖維間隔,并分割肝小葉形成假小葉,纖維間隔內(nèi)可見慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。在模型復(fù)制8、13周,護(hù)肝片組肝細(xì)胞的水變性、脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生均輕于模型組。模型復(fù)制8、13周,正常組與模型組肝纖維化分級(jí)比較,差異有顯著性(P<0.01)。

表1 大鼠CCl4性肝纖維化8、13周的病理學(xué)分級(jí)(單位:只)Table 1 Fibrosis grades of carbon tetrachloride-induced fibrotic liver in rats during 8 and 13 weeks(unit:number)

2.α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞在正常及纖維化大鼠肝組織中的分布及護(hù)肝片對(duì)其數(shù)量的影響

HE染色結(jié)合免疫組化染色結(jié)果觀察顯示,α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞位于竇周Disse間隙,形態(tài)不規(guī)則,胞體呈卵圓形或不規(guī)則。正常組、模型組及護(hù)肝片組肝組織中均有α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞,但其數(shù)量明顯的不同(表2)。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常組,且模型組的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)8周明顯高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化 8周、13周,護(hù)肝片組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著低于模型組。

3.NF-κB p65蛋白在 CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護(hù)肝片對(duì)其表達(dá)的影響

正常對(duì)照組大鼠肝組織較少表達(dá)NF-κB p65蛋白(圖1,圖4),模型組大鼠肝組織則有較強(qiáng)的NF-κB p65蛋白表達(dá),分布在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中(圖2,圖5)。NF-κB p65蛋白的陽(yáng)性染色分布于纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞,脂肪變性和水變性的肝細(xì)胞也可見陽(yáng)性染色。表3顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,模型組肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)量顯著高于正常組。模型組肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)量8、13周相比差異無(wú)顯著性。大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,護(hù)肝片(圖3,圖6)顯著地抑制纖維化肝組織 NF-κB p65蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

表2 護(hù)肝片對(duì)CCl4所致纖維化大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響(單位:個(gè))Table 2 Effect of Liver-aid tablets on the number of α-SMA positive cells in carbon tetrachloride-induced fibrotic liver tissue(unit:number)

表3 護(hù)肝片對(duì)CCl4所致纖維化大鼠肝組織NF-κB p65蛋白表達(dá)量的影響Table 3 Effect of Liver-Aid tablets on expression of NF-κB p65 protein in carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats

4.TGF-β1及 TβR Ⅰ的 mRNA 在 CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護(hù)肝片對(duì)其的影響 正常肝組織不表達(dá)或僅微弱表達(dá) TGF-β1及TβRⅠmRNA,它們分布于胞質(zhì)和∕或胞核內(nèi)(圖7,圖 10,圖 13,圖 16);模型組 (圖 8,圖 11,圖 14,圖17)和護(hù)肝片(圖 9,圖 12,圖 15,圖 18)組肝組織均有較強(qiáng)的 TGF-β1及 TβRⅠmRNA 表達(dá),主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核上。TGF-β1及 TβRⅠmRNA的陽(yáng)性染色分布于變性的肝細(xì)胞、纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞。表4顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組肝組織 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著高于正常組。模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周 ,護(hù)肝片組肝組織 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著低于模型組,但仍顯著高于正常組。

表4 Liver-Aid tablets對(duì)CCl4所致纖維化大鼠肝組織 TGF-β1 mRNA、TβRⅠmRNA表達(dá)量的影響Table 4 Effect of Liver-Aid tablets on mRNA expression of TGF-β1 and TβR Ⅰin carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats

表5 造模8、13周正常組、模型組、Liver-Aid tablets組各數(shù)據(jù)間的相關(guān)系數(shù)Table 5 The correlation coefficient of data of normal group,model group,Liver-Aid tablets group between to each other during 8 and 13 weeks

5.相關(guān)分析

表5顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周,正常組、模型組及護(hù)肝片組大鼠肝組織的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)量相互間均呈顯著正相關(guān)。大鼠CCl4性肝纖維化13周,除α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與 TβRⅠmRNA表達(dá)量之間不相關(guān)之外,其余各數(shù)據(jù)之間均呈顯著正相關(guān)。

討 論

中藥護(hù)肝片(黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)是糖衣片,由柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子、豬膽粉、綠豆組成,有抗肝纖維化作用。本模型采用12.5%CCl4致大鼠肝纖維化的一般病理學(xué)改變結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞消失,匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)膠原纖維增生,分割肝小葉形成大方形及小方形假小葉,模型組的肝損傷及其纖維化分級(jí)均顯著高于正常組,表明CCl4致大鼠肝纖維化造模成功。8、13周模型組肝損傷的病理組織學(xué)變化及纖維化分級(jí)間無(wú)明顯差異,但13周較8周有發(fā)展加重趨勢(shì),這與8周肝纖維化已經(jīng)形成,而晚期(13周)肝纖維化可能處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)、膠原的合成與降解達(dá)到新的平衡有關(guān)。護(hù)肝片組的肝損傷及其纖維化分級(jí)均輕于模型組,進(jìn)一步證實(shí)護(hù)肝片對(duì)大鼠CCl4慢性肝損傷及其纖維化形成有抑制作用[2]。

肝纖維化是肝臟對(duì)各種損傷的修復(fù)反應(yīng),在肝臟炎癥損傷過程申,HSC活化發(fā)生表型轉(zhuǎn)變而具有肌成纖維細(xì)胞(MFB)的特性,使 ECM-膠原蛋白合成增加,細(xì)胞收縮性增強(qiáng),在肝纖維化的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,HSC活化是肝纖維化形成過程的中心環(huán)節(jié)[8],α-SMA是其活化的標(biāo)志[9]。本實(shí)驗(yàn)用12.5%CCl4致大鼠慢性肝損傷,α-SMA染色結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織活化的 HSC(即α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞)數(shù)量均較正常組顯著增多,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。證實(shí)在肝纖維化過程中活化的 HSC數(shù)量增多,即 HSC被活化并大量增殖。在大鼠CCl4性肝纖維化8、13周時(shí),模型組有明顯的肝纖維化形成,表明HSC的活化、增殖與ECM的沉積的現(xiàn)象是一致的,兩者關(guān)系密切。本次實(shí)驗(yàn)中,出現(xiàn)13周模型組活化的HSC數(shù)量較8周顯著減少這一有趣的現(xiàn)象,對(duì)這一現(xiàn)象的解釋目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,我們推測(cè)可能是由于晚期肝纖維化已處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),膠原的合成與降解處新的平衡所致,有待于進(jìn)一步研究。大鼠CCl4性肝纖維化8周,活化的HSC數(shù)量與NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表達(dá)均呈顯著正相關(guān);13周活化的 HSC數(shù)量也與NF-κB p65蛋白、TGF-β1mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān);8、13周,護(hù)肝片組肝組織活化的 HSC數(shù)量均較模型組顯著減少,提示:①肝纖維化時(shí) HSC的活化、增殖與 NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表達(dá)有關(guān);②護(hù)肝片的抗肝纖維化作用機(jī)制之一可能是抑制纖維化肝組織HSC的活化與增殖。

目前共克隆得到5種 TGF-β異構(gòu)體,命名為TGF-β1-5,在哺乳動(dòng)物僅有 TGF-β1-3[10]。在肝臟TGF-β1是各種 TGF-β異構(gòu)體中最主要的存在形式,TGF-β1含量較 TGF-β2、TGF-β3高約 10 倍 ,TGF-β1是強(qiáng)有力的致纖維化的細(xì)胞因子,在肝纖維化時(shí)表達(dá)明顯增多,促進(jìn) HSC增殖活化,合成大量 ECM,在纖維化進(jìn)程中起重要作用[5]。TGF-β1是肝纖維化主要的始動(dòng)因子之一,研究證實(shí)肝纖維化時(shí)其表達(dá)增加[11]。TGF-β產(chǎn)生時(shí)均以非活性狀態(tài)存在,與相應(yīng)受體無(wú)結(jié)合活性。肝受損時(shí),肝內(nèi)的炎癥細(xì)胞、HSC、KC等自分泌或旁分泌非活性 TGF-β1,非活性 TGF-β1被炎癥環(huán)境中的各種酶和細(xì)胞因子激活,刺激上述細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生 TGF-β1,形成逐級(jí)放大效應(yīng) ,導(dǎo)致 TGF-β1大量生成和激活。活性 TGF-β1通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β以自分泌和旁分泌方式參與 HSC的活化[5,12],促進(jìn) HSC合成各種膠原成分以及組織金屬蛋白抑制劑(TIM Ps),同時(shí)能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(NMPs)的合成,引起ECM積聚而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[13]。研究表明護(hù)肝片抑制纖維化大鼠肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ的蛋白的表達(dá)[2],試驗(yàn)結(jié)果顯示,在CCl4性大鼠肝纖維化中晚期,肝組織中 TGF-β1及 TβRⅠ的mRNA的表達(dá)均呈明顯一致性增多,表明在肝纖維化過程中,TGF-β1及 TβRⅠ表達(dá)增加是由于其轉(zhuǎn)錄水平增加所致,且 TGF-β1與 TβRⅠ在肝纖維化過程中有協(xié)同作用,在中晚期肝纖維化中起重要作用;模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周,護(hù)肝片在mRNA水平上抑制中晚期纖維化肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ的表達(dá),提示在肝纖維化不同時(shí)期,上述靶點(diǎn)的反應(yīng)性有所差異,可能受到多種因素的影響,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究;抑制TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)是護(hù)肝片抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。

TGF-β1的合成受核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,目前發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子主要有NF-κB、AP-1等。NF-κB在哺乳動(dòng)物中最多見的是由p65和p50組成的異源二聚體。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí),NF-κB位于細(xì)胞質(zhì),其p65亞基與抑制蛋白(Inhibitory kappa B,IκB)單體結(jié)合,覆蓋p50的核定位信號(hào),使NF-κB與IκB以三聚體失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激時(shí),IκB發(fā)生磷酸化,并從NF-κB二聚體上解離,暴露p50的核定位信號(hào),NF-κB得以激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1活化因子組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶(t TG)基因的啟動(dòng)子中含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn),因而 NF-κB能促進(jìn) TGF-β1表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組相比,8、13周模型組大鼠肝臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),而且8、13周NF-κB p65蛋白與 TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示 NF-κB參與肝纖維化反應(yīng),促進(jìn)肝纖維化形成;肝纖維化過程中,NF-κB可能在介導(dǎo)TGF-β1的活化或產(chǎn)生中發(fā)揮一定的作用[14],NF-κB也可能還進(jìn)一步在介導(dǎo) TβRⅠ的活化或產(chǎn)生中發(fā)揮一定的作用,有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,NF-κB p65蛋白的表達(dá)與活化的 HSC數(shù)量呈正相關(guān),提示 NF-κB參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,其機(jī)制之一是 NF-κB參與HSC的活化與增殖。大鼠 CCl4性肝纖維化8、13周,護(hù)肝片組肝組織NF-κBp65蛋白表達(dá)均較模型組顯著減少,提示:①NF-κB可能是護(hù)肝片抗肝纖維化作用靶點(diǎn)之一;②護(hù)肝片可能通過抑制纖維化肝組織NF-κB的表達(dá)從而影響 TGF-β1和 TβRⅠ的表達(dá);③護(hù)肝片可能通過抑制纖維化肝組織NF-κB的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致纖維化肝組織活化的 HSC數(shù)量減少。

組織芯片(tissue chip)又稱組織微陣列(tissue microarray),是將幾十個(gè)甚至幾百個(gè)組織按預(yù)先設(shè)計(jì)的要求在某一載體上排列成矩陣的微縮組織切片。它具有平行、高通量對(duì)組織進(jìn)行分析研究,節(jié)約組織原材料和檢測(cè)試劑,并因?qū)嶒?yàn)條件一致,從而減少實(shí)驗(yàn)誤差[15]。本研究制作了低密度肝組織芯片,直徑1mm的組織芯片包涵了3-5個(gè)肝小葉范圍,能充分展現(xiàn)肝纖維化的病理形態(tài)學(xué)改變。在組織芯片上做了 HE染色、網(wǎng)狀纖維染色、V G膠原纖維染色、免疫組化和原位雜交,既節(jié)約試劑成本、減輕實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度,又減少了實(shí)驗(yàn)誤差,提高了不同組織之間染色結(jié)果的可比性。制作組織芯片過程中用定位器進(jìn)行定位,使所取得的組織片具有代表性,收到較好效果,為中藥抗肝纖維化的研究提供了新的思路。

[1]廖明,李彥,舒?zhèn)?Genistein對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖及TGF-β1、MMP-2和 TIMP-2表達(dá)的影響.世界華人消化雜志,2010,18(3):229-233

[2]吳義春,吳強(qiáng),楊雁,等.HSC的活化、增殖與 TGF-β1及其Ⅰ型受體在中晚期纖維化肝組織中的改變及護(hù)肝片對(duì)其的影響.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(1):80-86

[3]Luckey SW,Petersen DR.Activation of Kupffer cells during the course of carbon tetrachloride-induced liver injury and fibrosis in rats.Exp Mol Pathol.2001,71(3):226-40

[4]Hellerbrand C,Jobin C,Iimuro Y,et al.Inhibition of NFkappaB in activated rat hepatic stellate cells by proteasome inhibitors and an IkappaB superrepressor.Hepatology.1998,27(5):1285-1295

[5]Gressner AM,Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.J Cell Mol Med,2006,10:76-99

[6]張均田主編.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:1398-1400

[7]王寶恩,王惠吉,朱家璇,等.中藥復(fù)方丹參不同劑型治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察.肝臟病雜志,1993,1(1):64-72

[8]Guyot C,Lepreux S,Combe C,et a1.Hepatic fibrosis and cirrhosis:the(myo)fibroblastic cell subpopulations involved.Int J Biochem Cell Biol,2006,38(2):135-151

[9]Verrecchia F,Mauviel A.Transforming growth factor-beta signaling through the Smad pathway:role in extracellular matrix gene expression and regulation.J Invest Dermatol,2002,118(2):211-215

[10]Lawrence DA.Transforming growth factor-beta:an overview.Kidney Int Suppl,1995,49:S19-23

[11]吳強(qiáng),宋少剛,楊楓,等.大鼠肝纖維化中 PDGF和TGF-β1的動(dòng)態(tài)改變.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,38(5):340-342

[12]Zhang Xiao-xiang,Yang Yan,Wu Qiang,et a1.Effects of Kupffer cell-conditioned medium harvested at different time on proliferation and collagen production of HSC-T6 cells.Chin Pharm J,2004,39(2):110

[13]Prakobwong S,Pinlaor S,Yongvanit P,et a1.Time profiles of the expression of metalloproteinases,tissue inhibitors of metalloproteases,cytokines and collagens in hamsters infected with Opisthorchis viverrini with special reference to peribiliary fibrosis and liver injury.Int J Parasitol,2009,39(7):825-835

[14] 季國(guó)忠 ,趙志泉 ,繆林 ,等.TGF-β1、TGF-βR Ⅱ、NF-κB在肝細(xì)胞癌血管形成中的作用及機(jī)制探討.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2002,22(12):729-31

[15]Kononen J,Bubendorf L,Kallioniemi A,et al.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.Nat Med,1998,4(7):844-7

圖 版 說(shuō) 明

圖1 8wk正常組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)。×400

圖2 8wk模型組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)。×400

圖3 8wk護(hù)肝片組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?！?00

圖4 13wk正常組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?！?00

圖5 13wk模型組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?！?00

圖6 13wk護(hù)肝片組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?！?00

圖7 8wk正常組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?！?00

圖8 8wk模型組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?！?00

圖9 8wk護(hù)肝片組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)。×400

圖10 13wk正常組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)。×400

圖11 13wk模型組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?！?00

圖12 13wk護(hù)肝片組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?！?00

圖13 8wk正常組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

圖14 8wk模型組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

圖15 8wk護(hù)肝片組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

圖16 13wk正常組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

圖17 13wk模型組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

圖18 13wk護(hù)肝片組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?！?00

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.2 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.3 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.4 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.5 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.6 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining ×400

Fig.7 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.8 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.9 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 0 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 1 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 2 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 3 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 4 TβR ⅠmRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 5 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 6 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks. Hybridization in situ staining×400

Fig.1 7 TβR Ⅰ mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 8 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liveraid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Altered protein expression of NF-κBand mRNA expression of TGF-β1 and its type Ⅰreceptor and HSCs of hepatic tissue in the middleand late stage of rat hepatic fibrosisand the effect of liver-aid tabletson them

Wu Yichun＊,Wu Qiang＊1,Yang Yan1,Yang Feng1,Chen Minzhu1
(Dapartment of Pathology Anhui Medical College,Hef ei,Anhui,230601;1Department of Pathology Anhui Medical University,Hef ei,Anhui 230032,China)

Objective To study the effect of Liver-aid tablets on the activation and proliferation of hepatic stellate cells(HSCs)and protein expression of Nf kappaB(NF-κB)and mRNA expression of transforming growth factor beta-1(TGF-β1)and its type Ⅰreceptor(TβR Ⅰ)in the middle and late stage of rat hepatic fibrosis.Methods SD rats were divided into 3 group s:normal control,model control and group of Liver-aid tablets.CCl4(12.5%,4ml·kg-1)was injected subcutaneously in model rats twice a week for 8 and 13 weeks.The drug(921mg·kg-1in the group of Liver-aid tablets,but 0.5%CMC-Na in control groups)was given intragastrically once a day for 8 and 13 weeks.The rats were killed at the end of 8th and 13th week respectively,the left liver tissue was then used to make tissue microarrays(TMA)..IHC S-P method was used to detect the protein expression ofα-smooth muscle actin(α-SMA)and NF-κB p65,while the mRNA expression of TGF-β1and TRβ Ⅰwas detected by ISH.α-SMA positive cells were counted in three random 250μm ×250μm areas under light microscop(×200).The expression of NF-κB protein,TGF-β1and TβRⅠmRNA were quantified by MetaMorp h imaging analysis system.Results 1.Afeter 8 and 13 weeks,the degreesof liver injury and fibrosis grades in the model group were higher than those in the normal group(P<0.01),which was ameliorated remarkably by Liver-aid tablets.2.The number of activated HSCs in fibrotic model liver tissue was more than that in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).The protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰin the model group were stronger than those in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).3.Liver-aid tablets inhibited not only the activation and proliferation of HSCs,but also the protein expression of NF-κB and mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰof fibrotic liver tissue after 8 and 13 weeks(P<0.01).Conclusion Liver-aid tablets have anti-fibrosis effects on CCl4-induced rat liver fibrosis,which might be performed through the pathway of inhibiting the activation and proliferation of HSCs,the protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰ.

Hepatic fibrosis; Liver-aid tablets; HSC; NF-κB; TGF-β1; TGF-βR Ⅰ;Immunohistochemistry; In situ hybridization; Tissue microarrays

R322.47 R285.5

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.003

2010-12-14

2011-04-01

安徽省自然科學(xué)研究基金(99044126);安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2006KJ092A)

吳義春,男(1973年),漢族,副教授。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)