慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)成年海馬FGF-2的表達(dá)及神經(jīng)發(fā)生的影響

肖娟娟 王秋桂 張敏海

慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)成年海馬FGF-2的表達(dá)及神經(jīng)發(fā)生的影響

肖娟娟1＊王秋桂1張敏海2

(1咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室,湖北437100;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系組織與胚胎學(xué)教研室,武漢430030)

目的 通過(guò)觀察慢性復(fù)合應(yīng)激后大鼠海馬FGF-2表達(dá)的變化,來(lái)探討慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)FGF-2表達(dá)的影響及其與海馬神經(jīng)發(fā)生的聯(lián)系。方法 成年雄性大鼠隨機(jī)分為復(fù)合應(yīng)激組和正常對(duì)照組。復(fù)合應(yīng)激組動(dòng)物每天交替無(wú)規(guī)律暴露于復(fù)合應(yīng)激原中達(dá)6周。然后運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法、Western-blot和RT-PCR技術(shù)觀察海馬 FGF-2表達(dá)的變化。結(jié)果 慢性復(fù)合應(yīng)激組動(dòng)物海馬FGF-2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量增多(P<0.05);海馬FGF-2蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05);海馬FGF-2 mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 慢性復(fù)合應(yīng)激可引起海馬FGF-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量增加和FGF-2表達(dá)水平升高,提示應(yīng)激后內(nèi)源性FGF-2的表達(dá)增高可能是慢性復(fù)合應(yīng)激促海馬神經(jīng)發(fā)生的因素之一。

慢性復(fù)合應(yīng)激; 海馬; FGF-2; 神經(jīng)發(fā)生; 大鼠

FGF-2,又名bFGF,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,是由146個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽,能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞有絲分裂并具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,而且能促神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化[1-3]。有報(bào)道[4]認(rèn)為FGF-2參予了成年海馬神經(jīng)發(fā)生,外源性FGF-2還能促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)。本室在前期實(shí)驗(yàn)中多次證實(shí)慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)成年大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生[5,6],因此本實(shí)驗(yàn)采用4種應(yīng)激模型,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)6周的無(wú)規(guī)律間歇式復(fù)合應(yīng)激,然后采用免疫組織化學(xué)方法、Western-blot和RT-PCR技術(shù)分別對(duì)應(yīng)激后大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)源性FGF-2蛋白的表達(dá)和FGF-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定,旨在通過(guò)研究慢性復(fù)合應(yīng)激后海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)FGF-2蛋白及其mRNA的表達(dá)變化來(lái)探討慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的可能機(jī)制。

材料和方法

1.動(dòng)物分組及模型制備

成年雄性Wistar大鼠(湖北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)32只,體重150-200g。將動(dòng)物隨機(jī)分為2組:(1)正常對(duì)照組(n=16;簡(jiǎn)稱對(duì)照組);(2)慢性復(fù)合應(yīng)激組(n=16;簡(jiǎn)稱應(yīng)激組)。兩組動(dòng)物常規(guī)攝食飲水,動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度為18-22℃,光暗周期為12/12h。應(yīng)激組動(dòng)物每天隨機(jī)暴露于垂直旋轉(zhuǎn)(持續(xù)25-40s/間隔4-7min)、睡眠剝奪、捆綁、及夜間光照(持續(xù)4-7min/間隔12-20min)等4種應(yīng)激原中達(dá)6周,其中前3項(xiàng)于白天進(jìn)行,每天持續(xù)6 h;后者在晚間進(jìn)行,光照呈無(wú)規(guī)律、間歇式。

2.FGF-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色反應(yīng)

應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠各8只,7%水合氯醛麻醉,經(jīng)常規(guī)灌流固定,取腦并修取含海馬腦段,常規(guī)脫水,透明,石蠟包埋,冠狀連續(xù)切片,片厚5um,每個(gè)動(dòng)物均依次等距離間隔選取切片,共取8張,進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。所用主要試劑:兔抗FGF-2多克隆抗體(1:100,Santa Cruz公司);鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase complex,S-P)即用型試劑盒(北京中山試劑公司)。用1%抗體稀釋液替代兔抗FGF-2多克隆抗體進(jìn)行陰性對(duì)照,反應(yīng)呈陰性。在O-lympus顯微鏡高倍鏡下,利用Image-Pro Plus Version 5.0彩色圖像分析系統(tǒng)分析FGF-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積計(jì)數(shù)密度(簡(jiǎn)稱面密度N),并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(OD)。

3.海馬總蛋白提取與Western-blot的測(cè)定

應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠各8只,大鼠快速斷頭,取出腦組織并分離左側(cè)海馬:(1)提取海馬總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量,其蛋白含量在5-8mg/ml之間。(2)SDS-PAGE電泳:配制12%分離膠和5%濃縮膠,每孔加樣 20ul,電壓 110V進(jìn)行電泳。(3)轉(zhuǎn)膜:恒流275mA。(4)抗原抗體反應(yīng)及DAB/H2O2顯色,主要試劑為兔抗FGF-2多克隆抗體(1∶200),小鼠抗 GAPDH單克隆抗體(1∶5000,上海康成生物工程有限公司),HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G、羊抗小鼠Ig G(1∶5000,北京中山試劑公司)。應(yīng)用Image-Pro Plus Version 5.0軟件,以目的條帶FGF-2與內(nèi)參照 GAPDH的平均光密度比值表示FGF-2蛋白水平,進(jìn)行半定量分析。

4.海馬組織總RNA的提取與RT-PCR的測(cè)定

應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠各8只,大鼠快速斷頭,取出腦組織并分離右側(cè)海馬:(1)海馬總RNA的提取和鑒定。按RNA抽提試劑盒RNArose Reagent(上海華舜生物工程有限公司)步驟提取RNA。紫外分光光度計(jì)(UV-300,德國(guó) Eppendorf AG)檢測(cè) OD260/OD280在1.8-2.0之間,提取RNA:純度符合實(shí)驗(yàn)要求。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):反應(yīng)總體系40μl,含有樣品 RNA25μl。70℃孵育 5min,立即冰水浴,加入 M-MLV(100U/μl,Promega,USA)2μl,37℃溫浴90 min,90℃孵育5min終止反應(yīng),冰上冷卻。合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng):FGF-2及 GAPDH引物均根據(jù)GenBank登錄的大鼠目的基因cDNA序列,由上海Invitrogen公司合成。具體如下:上游引物 5’-CAGCTCCAAGCAGAAGAGAGA-3’;下游引物 5’-TGCCCAGTTCGTTTCAGT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 209 bp。內(nèi)參照GAPDH:上游引物 5’-CCC ACG GCA AGT TCA ACG G-3’;下游引物 5’-CTT TCCAGA GGG GCCATC CA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為428bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:反應(yīng)總體系 25?l,含有 cDNA 2μl,dNTP 1μl,10 ×buffer 2.5μl,MgCl2 1.5μl,Taq酶(購(gòu)自北京 TIANGEN公司)0.5μl,上下游引物各1μl,DEPC水 16μl。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45sec,62℃退火30sec,72℃延伸 45sec,共31個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸 8min。(4)PCR產(chǎn)物測(cè)定及分析:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)(復(fù)日 Smartview2001生物電泳圖像分析系統(tǒng)S/N:SV-0002202)對(duì)條帶進(jìn)行吸光光度值分析。以目的基因FGF-2與內(nèi)參照GAPDH的平均光密度的比值表示FGF-2 mRNA水平,進(jìn)行半定量分析。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)都用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.免疫組織化學(xué)方法顯示慢性復(fù)合應(yīng)激后海馬結(jié)構(gòu)中FGF-2的表達(dá)

FGF-2染色陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于對(duì)照組和應(yīng)激組海馬結(jié)構(gòu)中,CA1,CA3,齒狀回及其門區(qū)可見(jiàn)較多染成棕黃色的細(xì)胞,CA2區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)元胞核染色較深呈圓形或橢圓形。成年海馬的神經(jīng)發(fā)生存在于齒狀回的顆粒下區(qū),所以我們選擇齒狀回及其門區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行平均光密度(OD)分析,并且對(duì)單位面積下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目即面密度N(個(gè)/平方毫米)進(jìn)行比較。與對(duì)照組相比,應(yīng)激組齒狀回及其門區(qū)FGF-2陽(yáng)性細(xì)胞染色加深,其平均光密度提高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但二者面密度無(wú)明顯改變(P>0.05)(圖1,表1)。

圖1 對(duì)照組(A.B)和應(yīng)激組(C.D)大鼠海馬齒狀回及其門區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞的分布。SP法 (×100,DG齒狀回,Hi門區(qū))Fig.1 The expression of FGF-2 in the dentate gyrus and the hilusof the dentate gyrus between the control group(A.B)and the stressed group(C.D).(×100)

表1 齒狀回及其門區(qū)FGF-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度及面密度(mean±SD)Table 1 The immunohistochemical reaction in the dentate gyrus and the hilusof the dentate gyrus(mean±SD)

2.Western-blot分析慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)海馬組織FGF-2蛋白表達(dá)水平的影響

FGF-2和 GAPDH的分子量分別為17KD和36KD,條帶清晰。以 GAPDH的平均光密度值作為內(nèi)參照,對(duì)各組條帶的平均光密度值進(jìn)行校正,進(jìn)行半定量分析。與對(duì)照組相比,應(yīng)激組動(dòng)物海馬FGF-2蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2,表2)。

圖2 Western blotting檢測(cè)對(duì)照組(泳道1)和應(yīng)激組(泳道2)大鼠海馬 FGF-2蛋白水平。Fig.2 Thelevelsof FGF-2 protein in the rat hippocampus of control group(lane 1)and stressed group(lane 2)by Western blotting.

表2 海馬FGF-2蛋白的表達(dá)水平(mean±SD)Table 2 Expression levels of FGF-2 in hippocampus(mean±SD)

3.RT-PCR分析慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)海馬組織FGF-2 mRNA水平的影響

FGF-2和 GADPH mRNA擴(kuò)增的片斷長(zhǎng)度分別為209bp和428bp,條帶清晰,無(wú)雜帶出現(xiàn)。以GADPH的平均光密度值作為內(nèi)參照,對(duì)各組條帶的平均光密度值進(jìn)行校正,進(jìn)行半定量分析。與對(duì)照組相比,應(yīng)激組動(dòng)物海馬 FGF-2 mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05)(圖3,表3)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組(泳道1)和應(yīng)激組(泳道2)大鼠海馬FGF-2 mRNA水平。Fig.3 The levelsof FGF-2 mRNA in the rat hippocampus of control group(lane 1)and stressed group(lane 2).RTPCR

表3 FGF-2 mRNA在海馬中轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果(mean±SD)Table 3 Level of FGF-2 mRNA in the hippocampus(mean±SD)

討 論

1.慢性復(fù)合應(yīng)激促神經(jīng)發(fā)生

許多研究表明成年海馬齒狀回存在神經(jīng)發(fā)生[7,8],成年腦區(qū)神經(jīng)發(fā)生的部位主要局限于海馬齒狀回和環(huán)繞側(cè)腦室的室管膜下層。海馬齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞位于海馬門區(qū)與顆粒細(xì)胞層間的下顆粒帶(SGZ),其終身保持著增殖分化的能力,新生成的神經(jīng)元從門區(qū)移入顆粒層,接受內(nèi)嗅區(qū)突觸傳入沖動(dòng),通過(guò)苔狀纖維通路與CA3區(qū)形成突觸聯(lián)系,整合到海馬功能的神經(jīng)環(huán)路中。成年大鼠的DG區(qū)每天可生成數(shù)千個(gè)新神經(jīng)元,隨著年齡的增加,其神經(jīng)發(fā)生的能力隨之下降。這些成年神經(jīng)干細(xì)胞受到包括應(yīng)激在內(nèi)的多種因素的調(diào)控。許多研究表明單一應(yīng)激會(huì)抑制海馬神經(jīng)發(fā)生,使依賴海馬的空間學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生障礙[9,10]另有研究顯示,豐富的環(huán)境促進(jìn)海馬齒狀回前體細(xì)胞的增殖,可以拮抗年齡或腦損傷引起的神經(jīng)可塑性的降低,改善腦功能[11]。我室采用慢性復(fù)合應(yīng)激模型,改善了動(dòng)物應(yīng)激的條件,使其在豐富多變的環(huán)境下接受挑戰(zhàn)。多次研究證實(shí):慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生[5,6],應(yīng)激后動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力提高[12-14]。

2.慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)FGF-2的表達(dá)

FGF-2是一種重要的促有絲分裂劑,廣泛存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng),在腦內(nèi)主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)。海馬CA2區(qū)的錐體神經(jīng)元和紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元也存在FGF-2[15]。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法觀察到FGF-2在腦內(nèi)廣泛表達(dá),而成年海馬神經(jīng)發(fā)生主要位于齒狀回,所以我們對(duì)齒狀回及其門區(qū)FGF-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析得出,慢性復(fù)合應(yīng)激后細(xì)胞表達(dá)FGF-2的量增加而免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目并無(wú)增加。Western-blot和 RT-PCR技術(shù)也分別得到,應(yīng)激后海馬 FGF-2蛋白及mRNA水平提高。提示慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)海馬 FGF-2的表達(dá)可能是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)FGF-2mRNA的合成及蛋白表達(dá),并未增加表達(dá)FGF-2的細(xì)胞數(shù)。

3.FGF-2促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,內(nèi)源性或外源性FGF-2都對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生有一定的促進(jìn)作用[16,17]。局部的細(xì)胞和分子微環(huán)境也會(huì)影響海馬內(nèi)多潛能神經(jīng)前體細(xì)胞在不同的條件下選擇不同的命運(yùn),FGF-2的增加是其影響因素之一。Palmer等[18]將取自成年腦內(nèi)能產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞的部位如腦室下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞,在體外培養(yǎng)中加入 FGF-2后能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)FGF-2不僅可以起到有絲分裂原的作用還能促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)元的方向分化。

我們推測(cè)FGF-2的表達(dá)增加是慢性復(fù)合應(yīng)激促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制之一。FGF-2可能通過(guò)兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮生理作用,一是經(jīng)受體--胞漿激酶鏈入核,啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄;另一經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞--胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)--核孔復(fù)合體入核作用于靶基因,調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移和分化[19]。而 FGF-2又是通過(guò)何種途徑促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的?其一,FGF-2通過(guò)兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑直接作用于SGZ神經(jīng)前體細(xì)胞,促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖遷移分化為神經(jīng)元。其二,Doetsch F等發(fā)現(xiàn)在成年哺乳動(dòng)物室管膜下區(qū)的星型膠質(zhì)細(xì)胞顯示出神經(jīng)干細(xì)胞的特性[20],Seri B也發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞可生成新的神經(jīng)細(xì)胞[21],同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞還能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)成年干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[22]。而 FGF-2主要在星型膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),應(yīng)激后表達(dá)增加,提示FGF-2可能促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生新的神經(jīng)元。其三,Yamashima T等人研究證實(shí)腦缺血后海馬SGZ增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞大部分起源于毛細(xì)血管的周細(xì)胞和/或動(dòng)脈外膜細(xì)胞[23],FGF-2可能同時(shí)也促進(jìn)毛細(xì)血管的周細(xì)胞和/或動(dòng)脈外膜細(xì)胞分裂產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)而分化為神經(jīng)元。

成年海馬神經(jīng)發(fā)生的影響因素很多,慢性復(fù)合應(yīng)激增強(qiáng)FGF-2的表達(dá),從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生只是其中之一,慢性復(fù)合應(yīng)激后BDNF表達(dá)也有增加[24],FGF-2與BDNF及其它因子的協(xié)同作用還有待進(jìn)一步研究。

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Expression of FGF-2 in rat hippocampusafter chronic multiple stressand its effect on neurogenesis

Xiao Juanjuan1＊,Wang Qiugui1,Zhang Minhai2
(1Department of Histology and Embryology,Medical School,Xianning University,Hubei 437100;2Department of Histology and Embryology Tongji Medical School,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To explore the relationship of FGF-2 with hippocampal neurogenesis by observing the effect of chronic multiple stresson the expression of FGF-2 in the hippocampus of rats.Methods Adult male Wistar rats were randomly divided into two groups:the multiple stressed group and the control group.Rats in the multiple stressed group were irregularly and alternatively exposed to the chronic multiple stressfor 6 weeks.Then the expression of FGF-2 immunoreactive positive cells in the hippocampus of ratsof two groups were compared by using immunohistochemisery,and the expressionsof FGF-2 protein and mRNA in the hippocampusof rats were assayed by using Western-blot and RT-PCR respectively.Results(1)The expression of FGF-2 immunoreactive cells in the hippocampusof the multiple stressed rats was significantly higher than in the control group(P<0.05);(2)The protein and mRNA levelsof FGF-2 in,the hippocampus of the multiple stressed rats were remarkably higher than those of the control group(P<0.05).Conclusion The enhanced expression of FGF-2 in the hippocampus may be induced by the chronic multiple stress,and it implies that endogenous FGF-2 may play a rolein facilitating hippocampal neurogenesis in stressed rats.

Chronic multiple-stress; Hippocampus; FGF-2; Neurogenesis; Rat

R322.811

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.016

2011-01-06

2011-03-22

咸寧學(xué)院校級(jí)基金資助(KY0876)

肖娟娟,女(1983年),漢族,助教。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)