急性胰腺炎實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀

李昌陽(yáng)，禇朝順(綜述)，汪寶林(審校)

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，南京210011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是普外科最常見(jiàn)的急腹癥之一，發(fā)病急、進(jìn)展快、并發(fā)癥多，病死率高［1］。AP的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，且治療也未能總結(jié)出卓有成效的方案。因此，建立一個(gè)可靠的胰腺炎模型對(duì)AP發(fā)病機(jī)制、病理生理以及治療效果的研究是至關(guān)重要的?，F(xiàn)將近年來(lái)AP模型的研究進(jìn)展與發(fā)展前景作如下綜述。

1 AP模型動(dòng)物的選擇

1.1 常規(guī)動(dòng)物 目前用于制備胰腺炎模型的動(dòng)物主要有犬、大鼠、小鼠，有的也用貓、兔、猴等，其中犬和大鼠是制作胰腺炎模型較常用的動(dòng)物。犬的消化系統(tǒng)發(fā)達(dá)，與人有相同的消化過(guò)程，且易飼養(yǎng)，不易生病、死亡，特別適合消化系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究;而大鼠繁殖快而多，價(jià)格便宜，易飼養(yǎng)，胰腺薄而分葉，誘發(fā)胰腺炎后耐受力差，易死亡。但鑒于經(jīng)濟(jì)和操作困難，目前實(shí)驗(yàn)研究中仍多采用大鼠或小鼠。

1.2 基因工程動(dòng)物 基因工程動(dòng)物運(yùn)用轉(zhuǎn)基因、基因打靶及基因剔除等技術(shù)，較多應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究，比如通過(guò)在大鼠體內(nèi)過(guò)度表達(dá)內(nèi)皮素來(lái)證實(shí)內(nèi)皮素參與胰腺炎的發(fā)病機(jī)制;用基因剔除小鼠來(lái)證明血小板在AP中的作用［2，3］?？梢?jiàn)應(yīng)用基因工程動(dòng)物可使實(shí)驗(yàn)方法更簡(jiǎn)單，具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但其費(fèi)用昂貴，操作要求高，國(guó)內(nèi)目前應(yīng)用不多。

2 AP模型常用方法

2.1 侵入性方法

2.1.1 胰膽管注射法 目前胰膽管注射法運(yùn)用最為廣泛，根據(jù)反流學(xué)原理向胰膽管中注入不同外源性的物質(zhì)，直接損傷胰腺組織或通過(guò)激活內(nèi)源性胰酶損傷胰腺來(lái)建立AP模型。此法的優(yōu)點(diǎn):臨床意義較強(qiáng)，造模成功率高，可重復(fù)性，程度易控制。但是其操作精細(xì)，易形成膽漏，病死率較高。1980 年，Aho 等［4］首次采用切開(kāi)大鼠十二指腸前壁，再經(jīng)十二指腸乳頭插入塑料管，向胰膽管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c(sodium taurocholate，ST)成功復(fù)制了AP模型，24 h內(nèi)胰腺細(xì)胞即可出現(xiàn)水腫、出血、壞死等。但是此方法易損傷十二指腸血管引起出血，ST易經(jīng)胰膽管開(kāi)口和穿刺口溢出影響造模成功。如今在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量改進(jìn)，多采用經(jīng)十二指腸直接穿刺法，找到十二指腸乳頭并確定膽胰管開(kāi)口，在其對(duì)側(cè)腸系膜無(wú)血管區(qū)鉆一小孔將導(dǎo)管逆行插入膽胰管，也可采用直接胰膽管逆行穿刺法，直接經(jīng)膽胰管穿刺逆行注射誘導(dǎo)劑復(fù)制AP。對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)十二指腸直接穿刺法明顯優(yōu)于直接胰膽管逆行穿刺法，但胰膽管直接穿刺法操作方便，在某些短期研究中仍可選用［5］。

胰膽管注射法所致胰腺炎的嚴(yán)重程度和注入藥物、注入藥物時(shí)的濃度、計(jì)量、速度等密切相關(guān)。目前較常注入的藥物有ST、脫氧膽酸，此外還有乙醇、生理鹽水、細(xì)菌及毒素(如大腸埃希菌、葡萄球菌的菌體或毒素)、胰酶或者胰酶激活劑等［6-8］。不同的濃度造成的損傷也不同，現(xiàn)多集中在通過(guò)控制注射物質(zhì)的濃度來(lái)控制病變程度及動(dòng)物的病死率［9］。有學(xué)者對(duì)不同濃度的ST誘導(dǎo)AP模型進(jìn)行了系列研究，分別采用濃度為 0.25%、1.0%、2.0%、3.5% 的ST溶液1 mL/kg逆行注入大鼠胰管，結(jié)果1.0%和2.0%ST分別誘導(dǎo)輕度及重度水腫型胰腺炎;3.5%的ST則誘導(dǎo)壞死型胰腺炎，可見(jiàn)胰腺病變程度與ST誘導(dǎo)濃度呈正相關(guān)。Wittel等［10］也證實(shí)了胰腺病變程度與ST誘導(dǎo)濃度呈正相關(guān)，濃度為5%的ST溶所致的病變程度稍重于4%的ST，但是病死率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)4%ST。邱嘉華等［11］指出濃度為4.5%的ST誘導(dǎo)急性壞死性胰腺炎大鼠模型具有較高的多器官功能障礙綜合征發(fā)生率和24 h生存率，是急性壞死性胰腺炎并發(fā)多器官功能障礙綜合征診治研究的理想建模濃度?，F(xiàn)在常用的濃度為3%～5%［12，13］，注入速度不同，病變的程度也不同，所以微量泵被廣泛應(yīng)用于控制注入的速度［14］。

此外，聯(lián)合應(yīng)用硬膜外導(dǎo)管和創(chuàng)面封閉膠封閉穿刺孔，創(chuàng)傷小，不易出血和形成瘺，操作簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)成功率高，模型穩(wěn)定。熟練、精細(xì)的顯微手術(shù)技術(shù)也是成功建立模型的關(guān)鍵。

2.1.2 結(jié)扎法 包括單純胰管結(jié)扎法和十二指腸閉襻結(jié)扎法。此方法與人體膽汁回流引起的AP類似。其基本理論基礎(chǔ)是“胰酶自身消化學(xué)說(shuō)”和“膽管阻塞及共同通路學(xué)說(shuō)”的理論，機(jī)制為膽胰管腔內(nèi)壓力增高，使膽汁反流入胰管，膽汁破壞了胰管上皮的黏膜屏障，反流入胰管的膽汁卵磷脂被胰液的磷脂酶A分解為可破壞細(xì)胞膜和導(dǎo)管的溶血卵磷脂，胰內(nèi)蛋白酶被激活，導(dǎo)致胰腺組織的自我消化，造成胰腺水腫、出血和壞死。具體操作是:剖腹后，結(jié)扎進(jìn)入十二指腸的胰膽管或單獨(dú)結(jié)扎胰管。1957年，Pfeffer等［15］首先提出了十二指腸閉襻結(jié)扎法，結(jié)扎十二指腸乳頭近、遠(yuǎn)兩端腸腔導(dǎo)致十二指腸內(nèi)容物(膽汁、胰液和腸內(nèi)容物)反流入閉襻環(huán)，反流入膽胰管，可誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的AP，但是可并發(fā)高度胃潴留。Foitzik等［16］還認(rèn)為反流的內(nèi)容物往往易被細(xì)菌感染，動(dòng)物易引起靜脈瘀血和腸缺血而死于難治性的敗血癥，并且結(jié)扎的腸管易引起梗阻和缺血壞死。后來(lái)有研究者對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)［17］，把十二指腸近端離斷兩端閉合，結(jié)扎膽總管，胃與遠(yuǎn)端十二指腸吻合，使胰液流入閉襻，隨其內(nèi)壓的增高而發(fā)生反流，形成急性壞死性胰腺炎。結(jié)扎法優(yōu)點(diǎn)是具有臨床意義，是符合人類急性膽源性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的理想模型。但是操作復(fù)雜，容易造成腸梗阻，甚至腸管缺血性壞死，且胰腺壞死可逆性差，動(dòng)物病死率高。

2.1.3 胰腺被膜下注射法 薛建國(guó)等［18］用濃度為5%的ST 1 mL/kg，從胰尾部開(kāi)始被膜下多點(diǎn)緩慢均勻注入，0.5 h后出現(xiàn)胰腺明顯充血水腫及少量腹水，2 h后胰腺部分壞死。Liu等［19］用濃度為3.8%的ST 1 mL/kg被膜下注射成功復(fù)制重癥AP模型。被膜下注射法的機(jī)制是胰腺被膜下注射ST后，早期直接化學(xué)刺激引起被膜下胰腺組織損傷，后期膽鹽激活胰酶產(chǎn)生自身消化，使胰腺進(jìn)一步損害。此方法簡(jiǎn)單，易于操作，省時(shí)省力，可快速大批地建立AP動(dòng)物模型，此外病程進(jìn)展緩慢，病死率相對(duì)較低，適用于觀察病程進(jìn)展及評(píng)價(jià)藥物治療效果。缺點(diǎn)是易損傷被膜下血管導(dǎo)致出血，影響模型損傷的評(píng)價(jià)。

2.2 非侵入性方法

2.2.1 L-精氨酸腹腔注射法 1984年，Mizunuma等［20］首次通過(guò)單劑量腹腔注射L-精氨酸(5.0 g/kg)建立急性壞死性胰腺炎模型。此后研究者在不同劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的影響方面進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為最有效的計(jì)量為 2.5～ 5.0 g/kg［21］。一次大劑量注射L-精氨酸即可引起急性壞死性胰腺炎，但是有時(shí)需要多次注射，胰腺損傷程度取決于注入的量。給予低劑量的L-精氨酸(2.5 g/kg)組織學(xué)會(huì)發(fā)生輕度變化，包括間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡細(xì)胞脫顆粒［22］。單次大劑量的注入 L-精氨酸(4.5 g/kg)會(huì)出現(xiàn)腺泡細(xì)胞的破壞［23］。L-精氨酸腹腔注射法的機(jī)制尚不明確，可能為其毒性抑制鳥(niǎo)氨酸脫氫酶，阻止了核酸的合成，從而干擾了蛋白質(zhì)的合成，而胰腺細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成極為活躍。因此，極易受損傷。此外，其機(jī)制還認(rèn)為和一氧化氮、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧自由基密切相關(guān)。此法的優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)無(wú)創(chuàng)傷、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、易控制、對(duì)其他臟器如肝、腎、肺損傷較小，適用于AP各階段病變機(jī)制和防治的研究。缺點(diǎn)是臨床意義較差。

2.2.2 雨蛙素注射法 當(dāng)向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物給予大量的促分泌素時(shí)會(huì)促使消化酶大量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致AP?，F(xiàn)在促分泌素多使用膽囊收縮素的模擬物雨蛙素，其具有較強(qiáng)刺激膽囊收縮和胰酶分泌的作用。Lampel等［24］首次用雨蛙素注射法成功復(fù)制了AP模型。此后雨蛙素在復(fù)制AP模型中廣泛運(yùn)用。雨蛙素的給藥途徑可通過(guò)腹腔注射(50 μg/kg)、靜脈注射(5 μg/kg)或者皮下注射(50 μg/kg)。損傷的程度由注射量來(lái)控制，一般損傷程度較輕，多為急性水腫型胰腺炎，大劑量多次注射可引起急性壞死性胰腺炎。Sarmiento 等［25］每小時(shí)皮下注射雨蛙素 20 μg/kg，連續(xù)注射4 h，成功復(fù)制了AP模型。李全生等［26］以雨蛙素腹腔注射(50 μg/kg)，每小時(shí)注射1次，共7次，成功復(fù)制了急性壞死性胰腺炎模型。雨蛙素注射法的機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)認(rèn)為可能是其刺激胰腺導(dǎo)致胰液過(guò)度分泌和胰液內(nèi)胰蛋白酶活性增加所致。此法優(yōu)點(diǎn)為誘導(dǎo)迅速、相對(duì)無(wú)創(chuàng)傷、重復(fù)性高、適用性強(qiáng)、符合人類AP的早期表現(xiàn)，也是AP引起肺損傷的理想模型。但是雨蛙素價(jià)格昂貴、臨床意義一般。

2.2.3 喂飼法 1975 年，Lombardi等［27］首次用0.5%無(wú)膽鹽乙硫氨酸喂食小鼠復(fù)制出急性出血性胰腺炎伴大量脂肪壞死。4 d后病死率為100%，腹腔內(nèi)脂肪壞死不斷進(jìn)展，亦可出現(xiàn)腹水、缺氧、低血容量、酸中毒等癥狀。無(wú)膽堿乙硫氨酸喂飼法的機(jī)制尚不明確，可能為乙硫胺酸干擾了胰腺RNA、蛋白質(zhì)、磷脂代謝，膽堿不足使得這種作用得到加強(qiáng)，進(jìn)一步加重病情。雌激素在這一過(guò)程中也起到一定作用，因?yàn)闊o(wú)膽堿乙硫氨酸喂食對(duì)雌鼠敏感。該法優(yōu)點(diǎn):非創(chuàng)傷、對(duì)內(nèi)環(huán)境影響小、與人體AP生理過(guò)程相似。但是該方法只限用于小動(dòng)物，雄鼠對(duì)無(wú)膽堿乙硫氨酸喂飼不敏感，病程較長(zhǎng)，有高血糖和低血鈣等明顯內(nèi)分泌紊亂，直接損傷大腦肝臟、不適合研究AP引起的多器官功能障礙綜合征。

2.3 其他方法 包括電針刺激法、離體胰腺灌流法、病毒感染法、免疫法等，但是由于存在顯著的缺點(diǎn)，目前應(yīng)用不是很廣泛。鑒于各種方法各有其弊端，有學(xué)者嘗試聯(lián)合法，Kleinhans等［28］靜脈注射雨蛙素聯(lián)合腹腔注射脫氧膽酸成功復(fù)制了重癥AP模型。Hartwig等［29］逆行胰膽管注入脫氧膽酸氫氧化鈉緩沖液進(jìn)聯(lián)合靜脈注射雨蛙素成功誘導(dǎo)重癥AP模型。聯(lián)合法揚(yáng)長(zhǎng)避短，結(jié)合了各種方法的優(yōu)點(diǎn)，目前使用越來(lái)越廣泛。

4 結(jié)語(yǔ)

各種模型都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，目前尚無(wú)一種模型與人類AP的病理生理及發(fā)病機(jī)制完全一致，近年來(lái)對(duì)于建立AP模型進(jìn)行了廣泛的研究，已經(jīng)大大提高了與人類AP的相似度，研究者可根據(jù)自己的研究目的來(lái)選擇不同的模型。在對(duì)于AP模型不斷完善的同時(shí)，人們對(duì)AP的機(jī)制、病理生理及治療等方面的認(rèn)識(shí)必將得到更進(jìn)一步的提升。

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