鮑曼不動(dòng)桿菌16SrRNA甲基化酶的研究進(jìn)展

張利娟(綜述)，郝邯生(審校)

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院傳染科，天津300162)

鮑曼不動(dòng)桿菌為條件致病菌，可引起醫(yī)院內(nèi)特別是重癥監(jiān)護(hù)病房中危重患者的各種感染，包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、皮膚和軟組織感染、傷口感染、繼發(fā)性腦膜炎、血行感染［1］等。鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)感染的重要病原菌，在革蘭陰性桿菌所致的院內(nèi)感染中位居前四位［2］，在重癥監(jiān)護(hù)病房非發(fā)酵菌感染中居第一、二位［3，4］。細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥甚至泛耐藥菌株正以驚人的速度增加，近年來(lái)又出現(xiàn)了 XDR(extreme drug resistance)［5］和超級(jí)細(xì)菌［6］，并在世界范圍內(nèi)播散，給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。氨基糖苷類抗菌藥在治療嚴(yán)重細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)就介導(dǎo)革蘭陰性菌尤其是鮑曼不動(dòng)桿菌氨基糖苷類抗菌藥耐藥的一種新機(jī)制16SrRNA甲基化酶綜述如下。

1 氨基糖苷類抗菌藥及其細(xì)菌耐藥

氨基糖苷類作為一類高效、廣譜、殺菌類藥物廣泛應(yīng)用于臨床，特別是治療革蘭陰性菌所致的嚴(yán)重感染。該類藥物作用于細(xì)菌核糖體30S亞基的16SrRNA高度保守的A區(qū)，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而引起細(xì)菌死亡。根據(jù)核糖體作用部位的不同，氨基糖苷類可分為以下幾類:①與A位點(diǎn)結(jié)合的氨基糖苷類，包括4，6-二取代脫氧鏈霉胺類?？敲顾亟M——阿貝卡星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素;慶大霉素組——慶大霉素、西索霉素、異帕米星、奈替米星。4，5二取代脫氧鏈霉胺類:如新霉素、巴龍霉素、青紫霉素A、核糖霉素。不同于以上結(jié)構(gòu)的其他氨基糖苷類(如安普霉素)。②非A位點(diǎn)結(jié)合的氨基糖苷類，如鏈霉素、壯觀霉素等［7］。細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類耐藥主要是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶。

2003年質(zhì)粒編碼的16SrRNA甲基化酶作為介導(dǎo)高水平氨基糖苷類耐藥的新機(jī)制出現(xiàn)。迄今為止，7種16SrRNA甲基化酶基因armA［8］、rmtA［9］、rmtB［10］、rmtC［11］、rmtD［12］、rmtE［13］和npmA［7］已經(jīng)在世界范圍的腸桿菌科、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌中出現(xiàn)，檢出率0.03%～95.00%不等，這種差異取決于細(xì)菌的樣本量，特別是對(duì)氨基糖苷類的耐藥水平。此外，不同類型的甲基化酶存在于不同地區(qū)不同細(xì)菌種屬中，rmtA最初發(fā)現(xiàn)只存在于日本和韓國(guó)銅綠假單胞菌中，rmtD只在拉丁美洲存在，鮑曼不動(dòng)桿菌僅檢測(cè)到armA［14］。

2 新的耐藥機(jī)制——16SrRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)

16SrRNA甲基化酶原本是抗生素產(chǎn)生菌(如鏈霉菌屬和小單孢菌屬)為免于被自身產(chǎn)生的抗生素殺滅，在S-腺苷甲硫氨酸協(xié)同下對(duì)rRNA的轉(zhuǎn)錄后甲基化，是一種自我保護(hù)機(jī)制，曾被認(rèn)為沒(méi)有臨床意義［15］。2003年，Galimand等［8］從泌尿系統(tǒng)分離的多重耐藥肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了16SrRNA甲基化酶armA，這是首次在臨床菌株中發(fā)現(xiàn)編碼該類酶的基因，該菌對(duì)4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥，對(duì)安普霉素、巴龍霉素、鏈霉素敏感。Yokoyama等［9］從銅綠假單胞菌AR-2中發(fā)現(xiàn)了16SrRNA甲基化酶rmtA，該菌對(duì)慶大霉素組、卡那霉素組及新霉素高水平耐藥［最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)＞1024 mg/L］，對(duì)鏈霉素敏感。2004年，Doi等［10］從黏質(zhì)沙雷菌S-95中發(fā)現(xiàn)了rmtB，該菌對(duì)慶大霉素組和卡那霉素組高水平耐藥，對(duì)新霉素和潮霉素B敏感。2006年，Wachino等［11］從奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)rmtC，該菌對(duì)慶大霉素組和卡那霉素組高水平耐藥(MIC＞1024 mg/L)，但對(duì)新霉素和鏈霉素敏感。2007年Doi等［12］從銅綠假單胞菌PA0905中分離出rmtD，該菌對(duì)阿貝卡星、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素的MIC值均高于256 mg/L，對(duì)安普霉素、新霉素和鏈霉素敏感。Wachino等［7］在多重耐氨基糖苷類的大腸埃希菌ARS3中分離出npmA，介導(dǎo)對(duì)卡那霉素組、慶大霉素組、新霉素、核糖霉素、阿普霉素、壯觀霉素耐藥(MIC＞256 mg/L)。2010年 Davis等［13］從牛分離出的耐慶大霉素和阿米卡星的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了rmtE。至此，7種16SrRNA甲基化酶介導(dǎo)對(duì)多種氨基糖苷類高水平耐藥基因被發(fā)現(xiàn)。鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶16SrRNA甲基化酶armA最早在韓國(guó)［16］發(fā)現(xiàn)，隨后北美［17］、中國(guó)大陸地區(qū)［18］也相繼報(bào)道。目前在鮑曼不動(dòng)桿菌中尚未發(fā)現(xiàn)其他編碼16SrRNA甲基化酶的基因型。

3 16SrRNA甲基化酶介導(dǎo)的氨基糖苷類耐藥機(jī)制

氨基糖苷類抗菌藥通過(guò)與細(xì)菌核糖體30S亞基16SrRNA上A位點(diǎn)的一個(gè)高度保守基元結(jié)合(該結(jié)構(gòu)由A1408·A1492堿基對(duì)和1492位點(diǎn)的腺苷突起組成的不對(duì)稱內(nèi)環(huán)形成的口袋結(jié)構(gòu))，影響翻譯的多個(gè)步驟，特別是誘導(dǎo)密碼子錯(cuò)讀，干擾蛋白質(zhì)合成，引起細(xì)菌死亡［8］。16SrRNA甲基化酶使細(xì)菌核糖體30S亞基16SrRNA的A位點(diǎn)中一個(gè)或幾個(gè)堿基甲基化，使氨基糖苷類不能與相應(yīng)靶位結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥［19］。armA使A位點(diǎn)G1405上的N-7甲基化，甲基化后阻礙G1405的N7與4，6-二取代脫氧鏈霉胺類3″氨基群之間的氫鍵形成，在空間上阻礙G1405與慶大霉素的環(huán)Ⅲ結(jié)合，甲基化也給G1405引入正電荷，不利于氨基糖苷類結(jié)合到解碼位點(diǎn)。其他介導(dǎo)4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥的16SrRNA甲基化酶也是甲基化G1405位點(diǎn)相應(yīng)的堿基。NpmA則甲基化16SrRNA的A1408上的N-1，同時(shí)介導(dǎo)對(duì)4，6二取代脫氧鏈霉胺和4，5二取代脫氧鏈霉胺類耐藥［7］。該類酶直接作用于氨基糖苷類藥物作用的靶位，引起對(duì)常用的幾乎所有氨基糖苷類高水平耐藥。這與氨基糖苷類修飾酶的耐藥機(jī)制不同，修飾酶作用的底物具有特異性，不會(huì)引起泛氨基糖苷類耐藥，且多為中等水平耐藥。

4 16SrRNA甲基化酶的傳播機(jī)制

目前已知的16SrRNA甲基化酶基因均位于質(zhì)粒上，又常與Ⅰ類整合子或轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)，這些結(jié)構(gòu)與基因的移動(dòng)、傳播有密切關(guān)系。

4.1 armA 分離自腹瀉豬的大腸埃希菌MUR050，其armA位于質(zhì)粒pMUR050上，該質(zhì)粒屬于質(zhì)粒IncN不相容群(分離自人的armA位于IncL/M質(zhì)粒上)。armA位于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子上，介導(dǎo)其在人和動(dòng)物分離的腸桿菌間傳播。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，受體菌也對(duì)4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥。該質(zhì)粒上一組負(fù)責(zé)質(zhì)粒復(fù)制、移動(dòng)和結(jié)合的基因(如repA、oriT、tra家族)，與來(lái)源于鼠傷寒沙門菌的IncN群不相容性結(jié)合性質(zhì)粒R46同源性99%，表明類R46復(fù)制子是armA的載體。研究發(fā)現(xiàn)，armA位于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn1548上，上游為轉(zhuǎn)座酶基因tnpU和由intⅠ1-ant 3″9-qacE△Ⅰ-sul1-orf513組成的Ⅰ類整合子，下游包括轉(zhuǎn)座酶基因tnpD、大環(huán)內(nèi)酯類外排泵基因mefE/ mel、大環(huán)內(nèi)酯類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因mph，兩側(cè)為兩拷貝的插入序列IS26［20］。armA復(fù)合型轉(zhuǎn)座子也存在于其他細(xì)菌中。分離自波蘭的弗氏枸櫞酸桿菌pCTX-M3也存在類似的復(fù)合型轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，其ant3″9上游還存在dhfrXⅡ基因。分離自法國(guó)肺炎克雷伯菌的armA位于結(jié)合性IncL/M型質(zhì)粒pIP1204上，其上游為ISCR1和轉(zhuǎn)座酶基因tnpU，下游為轉(zhuǎn)座酶基因tnpD，并與介導(dǎo)廣譜頭孢菌素類耐藥的blaCTXM相連［8］。大腸埃希菌也存在相同的遺傳環(huán)境。最近報(bào)道分離自雞大腸埃希菌pHNE的armA，其上游和上述報(bào)道相同，下游為 IS26、tnpA-Tn3-like和tnpA-Tn3-like結(jié)構(gòu)，表明IS26和轉(zhuǎn)座酶都參與armA的移動(dòng)播散［21］。Kang等［22］報(bào)道armA位于多個(gè)結(jié)合性質(zhì)粒上，如IncL/M、IncFIIAs、IncF、IncA/C、IncHI2，并且菌株對(duì)多種抗菌藥物耐藥。由多種不相容性群的結(jié)合性質(zhì)粒介導(dǎo)armA在腸桿菌科細(xì)菌間傳播可導(dǎo)致多重耐藥菌的產(chǎn)生。

鮑曼不動(dòng)桿菌armA的遺傳環(huán)境與腸桿菌科中復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn1548的遺傳環(huán)境基本相同，其上游orf513編碼轉(zhuǎn)座酶，形成ISCR1，并且常常與Ⅰ類整合子相連，轉(zhuǎn)座酶基因tnpU也位于上游，下游為轉(zhuǎn)座酶基因tnpD［17］。表明Tn1548是革蘭陰性菌不同種系間armA有效的移動(dòng)載體。

4.2 其他16SrRNA甲基化酶基因 銅綠假單胞菌AR-2的rmtA位于介導(dǎo)汞耐藥的轉(zhuǎn)座子Tn5041上，上游是轉(zhuǎn)座酶基因類似序列(序列1)和tRNA核糖轉(zhuǎn)移酶基因orfA，下游是類Na+/H－反向轉(zhuǎn)運(yùn)基因序列(序列2)。在AR-11中rmtA上游orfA被截?cái)啵蒊S6100取代，下游仍為序列2，rmtA兩端均有orfQ-orfI結(jié)構(gòu)［23］;黏質(zhì)沙雷菌S-95的rmtB位于非結(jié)合性但可電轉(zhuǎn)化入受體菌的大質(zhì)粒上，上游為一含blaTEM的轉(zhuǎn)座子 Tn3，下游是編碼轉(zhuǎn)座酶的開(kāi)放讀碼框orf2［10］。Doi等［24］又發(fā)現(xiàn)，rmtB 可能會(huì)被含有blaCTX-M的質(zhì)粒捕獲而傳播;奇異變形桿菌ARS68的rmtC位于含轉(zhuǎn)座酶tnpA的ISEcpI類似元件的下游［11］;銅綠假單胞菌PA0905的rmtD上游為整合子In163，兩側(cè)為ISCR14元件，下游為tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶基因和Tn5564部分結(jié)構(gòu)。肺炎克雷伯菌R2中rmtD下游為Ⅰ類整合子，兩側(cè)為IS26［25］;目前，rmtE只在牛源性大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，尚在研究中［13］;大腸埃希菌ARS3的npmA上游是3個(gè)開(kāi)放讀碼框orf3、orf4及orf5，下游為orf7和orf8。含二拷貝IS26元件，形成轉(zhuǎn)座單元［7］。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，16SrRNA甲基化酶在不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同菌種間分布具有明顯差異。此類酶最初發(fā)現(xiàn)于腸桿菌科中［8］，大腸埃希菌攜帶的種類最多，包括armA、rmtB、rmtE、npmA，肺炎克雷伯菌也已檢測(cè)到armA、rmtB，而在鮑曼不動(dòng)桿菌中只檢測(cè)到armA。該類耐藥決定因子常與其他耐藥基因共同存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)元件上，在不同菌種間廣泛傳播，導(dǎo)致多重耐藥菌株的流行，特別是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，使其對(duì)包括氨基糖苷類、碳青霉烯類等多種抗菌藥物耐藥。多重耐藥的機(jī)制及相關(guān)耐藥基因的播散成為微生物學(xué)、流行病學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。

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