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    蚯蚓纖溶酶殼聚糖微球的制備及性質(zhì)

    2011-12-09 07:03:32武金霞王英銳田志鵬李瑞張賀迎
    關(guān)鍵詞:藥率纖溶酶戊二醛

    武金霞,王英銳,田志鵬,李瑞,張賀迎

    (1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002;2.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心,河北保定 071002)

    蚯蚓纖溶酶殼聚糖微球的制備及性質(zhì)

    武金霞1,王英銳1,田志鵬1,李瑞1,張賀迎2

    (1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002;2.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心,河北保定 071002)

    以蚯蚓纖溶酶為生物大分子模式藥物,研究殼聚糖載藥微球的制備方法及對(duì)藥物活性和穩(wěn)定性的影響.以殼聚糖為原料,采用超聲乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球,分別吸附和包埋蚯蚓纖溶酶.在油水體積比15/1,攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min,1 m L戊二醛作為交聯(lián)劑,超聲處理5 min條件下乳化交聯(lián)制備微球,包埋法具有較高的載藥率和包封率,分別達(dá)到52.6%和48.7%,具有一定的緩釋效果,在72 h藥物累計(jì)釋放率約為65%.用生理鹽水溶出微球中的蚯蚓纖溶酶,電泳圖譜顯示,多數(shù)組分能被溶出,條帶沒(méi)有變化,在72 h內(nèi),包埋法活性總?cè)艹雎蔬_(dá)51.5%.

    蚯蚓纖溶酶;殼聚糖微球;載藥率;包封率;溶出率

    血栓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)多發(fā)病,死亡率高,致殘率高.當(dāng)血栓發(fā)生后,最有效的治療方法就是溶栓,近年來(lái),以蚯蚓纖溶酶(earthwo rm fibrinolytic enzymes,EFEs)為主要活性成分的溶栓藥在臨床上發(fā)揮著重要作用,如百奧蚓激酶膠囊、普恩復(fù)膠囊等.EFEs是一組多組分的絲氨酸蛋白水解酶,其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),不耐酸,多數(shù)組分不能耐受胃蛋白酶[1-3],目前EFEs劑型多為腸溶膠囊,雖能夠有效避免胃液的破壞,但仍不能克服生物大分子藥物生物利用度低的共有缺陷[4-5].

    殼聚糖(chitosan,CS)是甲殼素脫乙?;漠a(chǎn)物,具有良好的生物降解性、生物相容性、生物黏附性和促進(jìn)藥物吸收的作用,可作為化學(xué)藥物、多肽、蛋白質(zhì)藥物以及基因藥物的載體,具有藥物控釋、組織靶向、提高藥物穩(wěn)定性等多方面優(yōu)勢(shì),因而已成為近年來(lái)新型給藥系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)[6-7].以小分子藥物為模型的殼聚糖載藥微球報(bào)道較多[8-9],殼聚糖載蛋白類藥物微球的研究多以胰島素和牛血清白蛋白為模式藥物[10-11].但對(duì)EFEs殼聚糖微球的研究國(guó)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,國(guó)內(nèi)僅有陸一菱等嘗試制備了蚓激酶殼聚糖亞微粒,比蚓激酶白蛋白納米粒的載藥量有所提高[12].研究EFEs殼聚糖微球,在溶栓類藥物劑型改進(jìn)上是一個(gè)新的嘗試,可以提高EFEs穩(wěn)定性,延長(zhǎng)其有效時(shí)間,對(duì)擴(kuò)大其臨床應(yīng)用具有重要意義.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    殼聚糖(脫乙酰度99%,平均分子質(zhì)量45 900),購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司;司班80、體積分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛溶液(水合)、丙酮、液體石蠟、多聚磷酸鈉(TPP)、異丙醇均為分析純.蚯蚓纖溶酶凍干粉,購(gòu)自天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖公司.

    1.2 儀器

    紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通);冷凍離心機(jī)(Sigma公司);LGJ0-5冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠);水平搖床ZD-9556(太倉(cāng)市科教器材廠);JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所).

    1.3 方法

    采用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球.以體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液為溶劑,配制20 g/L殼聚糖乙酸溶液,抽濾除去少量未溶解雜質(zhì).將司班80加入一定體積的液體石蠟中,使之占反應(yīng)總體積的10%,攪拌15 m in,混合均勻.將10 mL殼聚糖乙酸溶液作為分散相加入到混合溶液中,繼續(xù)攪拌,乳化均勻后超聲波處理一定時(shí)間,加入一定體積戊二醛溶液,繼續(xù)攪拌30 min.

    反應(yīng)物于6 000 r/min離心5 min,棄去上層油相.用石油醚洗滌離心沉淀物3次,每次3 000 r/min離心10 m in,棄上層有機(jī)溶劑.再用異丙醇脫水2次,每次3 000 r/min離心5 m in,棄上層有機(jī)溶劑.將產(chǎn)物自然干燥,即得殼聚糖微球.考察油水比、轉(zhuǎn)速、戊二醛加量、超聲處理時(shí)間對(duì)微球性能的影響.

    包埋載藥微球的制備,在形成油包水乳液之前將EFEs溶解在殼聚糖乙酸溶液中,其他同上.

    吸附載藥微球的制備,所得空白微球浸泡在EFEs溶液中24 h,6 000 r/min離心5 min,所得沉淀冷凍干燥.

    1.4 微球載藥率與包封率的計(jì)算

    采用紫外吸收法測(cè)定EFEs濃度[13],Folin-酚法測(cè)定EFEs活力[14].載藥率表示進(jìn)入微球內(nèi)部的藥物占微球自身質(zhì)量的百分比,包封率表示被包入微球的藥物占藥物總量的百分比.載藥率=WC/WM×100%,包封率=WC/Wt×100%,其中WC為被包入微球的藥物的質(zhì)量,WM為微球質(zhì)量,Wt為加入藥物總質(zhì)量.

    1.5 蚯蚓纖溶酶體外釋放實(shí)驗(yàn)

    準(zhǔn)確稱量10 mg包埋有EFEs的濕微球,加入3 mL 0.1 mol/L PBS(p H 7.4)緩沖液,置于37℃恒溫振蕩器上振搖(120 r/min).間隔一定時(shí)間離心分離,取出0.5 mL上清液,同時(shí)補(bǔ)入0.5 m L新鮮PBS緩沖液,共累計(jì)溶出72 h.測(cè)定上清液中EFEs含量,計(jì)算累計(jì)釋放率.

    1.6 蚯蚓纖溶酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    按1.5溶出EFEs,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)EFEs條帶的變化.

    1.7 蚯蚓纖溶酶溶出活性保留率

    按1.5溶出EFEs,Folin-酚法測(cè)定EFEs活力,以溶出總酶活占微球總載藥酶活的百分比表示活性溶出率.

    2 結(jié)果

    2.1 油水體積比對(duì)乳化交聯(lián)殼聚糖微球性能的影響

    采用不同油水體積比分別制備殼聚糖微球,并對(duì)微球性能進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果見(jiàn)圖1,圖2.

    由圖1可以看出,包埋法的載藥率和包封率都高于吸附法.油水體積比影響殼聚糖在乳化液中的分散及微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu).當(dāng)油水體積比小于15/1時(shí),微球載藥率和包封率隨油水比的增大而增加,油水體積比繼續(xù)增大,微球載藥率和包封率變化不大.

    圖2 油水體積比對(duì)包埋法載EFEs微球累計(jì)釋放率的影響Fig.2 Effect of V(O)/V(W)on the release rate of m icrosphere encapsulated EFEs

    由圖2可以看出,包埋法制備的載藥微球在釋放初期前2 h內(nèi)有突釋現(xiàn)象,這是由于吸附在微球表面或以較弱的鍵與微球連接的藥物在較短的時(shí)間內(nèi)脫落造成.隨后藥物的釋放具有緩釋現(xiàn)象,油水體積比15/1和20/1所表現(xiàn)的緩釋效果相似,在72 h累計(jì)釋放率低于65%.綜合考慮,以油水體積比15/1為宜.

    2.2 轉(zhuǎn)速對(duì)乳化交聯(lián)殼聚糖微球性能的影響

    轉(zhuǎn)速對(duì)乳化交聯(lián)殼聚糖微球性能的影響見(jiàn)圖3,圖4.

    圖3 不同轉(zhuǎn)速對(duì)微球載藥率和包封率的影響Fig.3 Effect of the rotate speed on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

    由圖3可以看出,隨轉(zhuǎn)速增加,載藥率和包封率都有不同程度的增加,且包埋法較吸附法高.

    圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)包埋法載EFEs微球累計(jì)釋放率的影響Fig.4 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEs under different rotate rate

    圖4表明,增加轉(zhuǎn)速可制備更小的微球,突釋現(xiàn)象有一定改善,緩釋效果更明顯,72 h累計(jì)釋放率低于65%,600,800 r/m in與1 000 r/m in的緩釋曲線相似,綜合考慮載藥率和包封率,以800 r/min為宜.

    2.3 戊二醛加入量對(duì)殼聚糖微球的影響

    戊二醛作為常用的交聯(lián)劑具有較好的交聯(lián)效果,但是隨加入量的增加,微球交聯(lián)過(guò)密,硬度增大,并且微球之間容易粘連,造成載藥量減小(圖5).

    從圖6可知,戊二醛加量超過(guò)1.5 m L時(shí),制得微球交聯(lián)過(guò)密,硬度過(guò)大,在體外振蕩釋放條件下,EFEs較難從微球內(nèi)部緩釋出來(lái),導(dǎo)致釋放率過(guò)小.戊二醛加量低于0.5 mL時(shí),微球機(jī)械強(qiáng)度差,易崩解,藥物釋放不符合緩釋要求,戊二醛加量以1 m L為宜.

    圖5 戊二醛對(duì)微球載藥率和包封率的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

    圖6 不同戊二醛加量對(duì)包埋法載藥微球藥物累計(jì)釋放率的影響Fig.6 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEsat different glutaraldehyde concentration

    2.4 超聲處理對(duì)殼聚糖微球的影響

    超聲處理對(duì)殼聚糖微球的影響見(jiàn)圖7,圖8.

    圖7 超聲處理時(shí)間對(duì)微球載藥率和包封率的影響Fig.7 Effect of ultrason ic time on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

    由圖7可以看出,超聲與否對(duì)微球載藥率和包封率影響較大,但是超聲時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)微球影響較小,以超聲處理5 min為宜.

    圖8 不同超聲時(shí)間下包埋法EFEs微球的累計(jì)釋放率Fig.8 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEs under different ultrasonic time

    從圖8可以看出,超聲處理使得微球累計(jì)釋放率變小,72 h藥物累計(jì)釋放率在60%左右,緩釋能力增強(qiáng).超聲處理增強(qiáng)了液滴在液體石蠟中的分散性,制得的微球體積更小,比表面積更大,增大了微球的載藥能力和緩釋能力.

    2.5 優(yōu)化條件下制備載藥微球的性能

    在考察了油水體積比、轉(zhuǎn)速、超聲處理時(shí)間、戊二醛加量對(duì)微球性能的影響之后,在優(yōu)化的條件下吸附法和包埋法制備EFEs殼聚糖微球,載藥率和包封率均有所提高,包埋法的載藥率和包封率分別達(dá)52.6%和48.7%,緩釋效果沒(méi)有明顯變化.

    2.6 蚯蚓纖溶酶的溶出穩(wěn)定性及酶活保留率

    以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)從殼聚糖微球中溶出的蚯蚓纖溶酶,結(jié)果見(jiàn)圖9.

    圖9 微球溶出的蚯蚓纖溶酶電泳Fig.9 EFEs released from m icrosphere

    從圖9可知,EFEs原液為含有多個(gè)組分的混合物,經(jīng)過(guò)制備殼聚糖載藥微球和重新溶出,多數(shù)主要條帶能從微球中溶出,溶出量隨溶出時(shí)間延長(zhǎng)而增多,并未由于制備載藥微球而被破壞,可見(jiàn)本研究采用的方法能維持酶類藥物穩(wěn)定.包埋法微球中,溶出后酶液條帶較淺,是由于包埋法具有較強(qiáng)的緩釋效果,在一定時(shí)間內(nèi),溶出的 EFEs質(zhì)量較少.

    收集溶出72 h的酶液,冷凍干燥,測(cè)定酶活力與比活力,計(jì)算溶出率,結(jié)果見(jiàn)表1.

    表1 不同方法制備載藥微球的藥物溶出率Tab.1 EFEs dissolving rate from m icrospheremade by differentmethods

    由表1可知,2種方法制備的微球均具有較高的藥物溶出率,吸附法略高于包埋法,這是由于包埋法微球具有更好的緩釋性能,在72 h內(nèi)溶出藥物總質(zhì)量略少.

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),超聲處理和攪拌轉(zhuǎn)速是影響殼聚糖載藥微球性能的主要因素.超聲處理可以使液滴進(jìn)一步細(xì)化,制備的微球體積更小,比表面積更大,增大了微球的載藥能力和緩釋性能,但超聲處理的時(shí)間對(duì)微球性能影響不大,說(shuō)明一定的超聲處理時(shí)間就能起到細(xì)化微滴的作用.較高的攪拌轉(zhuǎn)速也有利于形成粒徑較小分布較集中的微球.

    吸附和包埋法載藥微球均有較好的緩釋效果.在前2 h內(nèi)有突釋現(xiàn)象,突釋可以在給藥后短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的血藥濃度.隨后藥物的釋放變得緩慢,是由于殼聚糖微球吸水后溶脹,微球的微孔孔徑縮小或消失,藥物只能通過(guò)微球骨架緩慢擴(kuò)散,另外,微球內(nèi)外藥物濃度差逐漸減小也可造成后期釋放緩慢.

    本實(shí)驗(yàn)制備的EFEs殼聚糖微球在生理鹽水中具有較高的穩(wěn)定性和溶出率,但在模擬胃液及小腸液的環(huán)境下的溶出率及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究.

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    Preparation of Chitosan M icrosphere Loaded Earthworm Fibrinolytic Enzymesand Its Properties

    WU Jin-xia1,WANG Ying-rui1,TIAN Zhi-peng1,LIRui1,ZHANG He-ying2
    (1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Research Center for Biotechnology,Hebei University,Baoding 071002,China)

    To study the p reparingmethodsof chitasonmicrospheresand investigate the influence in drug activity and stability when earthworm fibrinolytic enzymes(EFEs)wasas biomacromoleculemodel drug.The chitosan microsphereswere p repared by ultrasonic emulsification method,EFEswas encapsulated and adsorbed into microspheres respectively.Theoptimized factorswere as follow s.V(O)/V(W)was15/1,stirring speed was800 r/min,adding 1 mL of glutaraldehyde,ultrasonic treatment for 5 min.The loaded rate and encapsulation efficiency of the microsphere encapsulated EFEsat these conditionswere 52.6%and 48.7%respectively,themicrosphere pocessed the sustained releasing p roperty,the total releasing rate in 72 hours were about 65%.Physiological saline was used to dissolve the EFEs from microsphere,the photogram of PAGE indicated thatmostof the EFEs components could be dissolved,and no obvious changes could beobserved.The dissolved EFEsactivity was determined by Folin-phenolmethod,the results showed that the total dissolution rate of themicrosphere encapsulated EFEswas 51.5%w hen dipped in physiological saline for 72 hours.

    earthworm fibrinolytic enzyme;chitosan microsphere;drug loaded rate;encapsulation efficiency;dissolution rate

    Q 55

    A

    1000-1565(2011)04-0406-07

    2011-04-12

    河北大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目

    武金霞(1966-),女,河北曲陽(yáng)人,河北大學(xué)教授,博士,主要從事生物化學(xué)及基因工程藥物研究.

    E-mail:w jx6@163.com

    趙藏賞)

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