鞘內(nèi)注射巴氯酚對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其對脊髓GABA轉(zhuǎn)運體-1的影響

朱珊珊，譚珊珊，，曾因明

巴氯酚(baclofen，Bac)是 GABAB受體的激動劑，在脊髓的中間神經(jīng)元可產(chǎn)生突觸前和突觸后抑制效應(yīng)。在行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者鞘內(nèi)使用巴氯酚，可減少阿片類藥物的用量和慢性疼痛的形成［1］。目前的研究認為，巴氯酚的鎮(zhèn)痛作用可能與其促進抑制疼痛信息傳遞的遞質(zhì)如GABA、內(nèi)啡肽的釋放有關(guān)［2］，但具體機制還不清楚。GABA轉(zhuǎn)運體(GABA transporter，GAT)能夠高效地將突觸間隙的GABA轉(zhuǎn)運回細胞內(nèi)，從而終止GABA的突觸后效應(yīng)，因此GAT數(shù)目和功能的改變將直接影響間隙內(nèi)GABA的含量。已有研究表明，大鼠脊髓水平GAT-1表達的上調(diào)參與神經(jīng)病理性疼痛的形成。巴氯酚的鎮(zhèn)痛作用是否與其對GAT-1的影響有關(guān)，目前還不清楚。因此，本研究在坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠模型上，采用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)和Western blot方法，觀察鞘內(nèi)應(yīng)用GABAB受體激動劑巴氯酚對神經(jīng)病理性痛大鼠觸誘發(fā)痛、熱痛敏等特征性痛覺行為學(xué)反應(yīng)和脊髓GAT-1蛋白表達的影響，以探討巴氯酚對神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)病理性疼痛動物模型的制備 慢性坐骨

神經(jīng)結(jié)扎損傷(chronic constriction injury，CCI)致神經(jīng)病理性痛大鼠模型［3］的制備 SD♂大鼠，(250±20)g，飼養(yǎng)1周。戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射后，選擇左側(cè)后肢，消毒皮膚，切開皮膚，分離皮下及肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，以3-0絲線相隔1 mm松結(jié)扎4道，直到神經(jīng)外膜稍稍收壓為止，打結(jié)時可見左下肢肢體輕微抽動。逐層縫合。假手術(shù)組步驟與神經(jīng)結(jié)扎大鼠相同，但只暴露神經(jīng)，而不加結(jié)扎。

1.2 鞘內(nèi)給藥方法 將大鼠頭置于麻醉箱內(nèi)，吸入0.4 ml異氟烷。一手定位大鼠L5-6腰椎棘突，16 G粗針破皮，另一手持25 μl微量注射器，按 Mestre等［4］報道的方法刺入蛛網(wǎng)膜下腔，出現(xiàn)典型鼠尾側(cè)向甩動和抖動視為穿刺成功。藥物均溶于10 μl生理鹽水中，于10 s內(nèi)推完。停止吸入異氟烷后動物將在1 min內(nèi)恢復(fù)翻正反射。巴氯酚〔R(±)baclofen〕購自美國Sigma公司。

1.3 動物分組 行為學(xué)實驗部分，采用結(jié)扎大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)的方法建立神經(jīng)病理痛模型，神經(jīng)結(jié)扎后d 3出現(xiàn)痛覺過敏的大鼠32只隨機分為4組(n=8):Bac1組、Bac2組、Bac3組、NS組，鞘內(nèi)分別注射10 μl的 0.1、0.3、1.0 μg 巴氯酚、生理鹽水。分別于給藥前、給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24 h 測大鼠機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency，TWL)以及運動功能。免疫組織化學(xué)實驗部分，大鼠分為NS組與Bac組，鞘內(nèi)分別給予0.3 μg 巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl，分別于給藥前、給藥后1、4、8 h取大鼠脊髓腰段，用免疫組織化學(xué)方法檢測脊髓節(jié)段GAT-1免疫陽性染色的灰度值。Western blot實驗部分，SD大鼠分為NS組與Bac組，鞘內(nèi)分別給予 0.3 μg巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl，分別于給藥前、給藥后30 min、1、2、4、8、12 和 24 h 取大鼠脊髓腰段，用 Western blot方法測定脊髓節(jié)段GAT-1蛋白含量。

1.4 行為學(xué)指標的測定

1.4.1 機械縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)的測定 按Chaplan等［5］報道方法測定MWT。置大鼠于透明的有機玻璃箱中，底為(0.5×0.5)cm2的鐵絲網(wǎng)。實驗前使之適應(yīng)30 min。以不同折力(buckling force)的Von Frey纖毛(Stoelting公司，美國)刺激大鼠足底。從2.0 g開始，以up-down法推測閾值，并在閾值上下各刺激5次，用內(nèi)推法算出50%反應(yīng)閾值(即引起5次試驗中2.5次反應(yīng)的值)。最大折力為15 g，大于此值時記為15 g。每次實驗至少間隔15 s，并等刺激引起的行為反應(yīng)(如舔足等)完全消失后再給予下一次刺激。

1.4.2 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency，TWL)的測定 將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，將大鼠放入有機玻璃箱內(nèi)，使其自由活動30 min以適應(yīng)測試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在25℃±1.0℃。按 Hargreaves等［6］法用 BME-410A 型熱痛刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所制作)照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為TWL。刺激部位為緊貼玻璃板的后爪部分。當后爪移動時，停止照射。照射自動切斷時間為20 s，以防止組織損傷。整個實驗中，熱刺激強度保持相同。重復(fù)刺激5次，取后3次TWL的平均值［7］。

1.4.3 運動功能評分 為了評定和排除藥物對大鼠運動功能的影響，給藥后觀察動物運動情況并根據(jù)下述情況進行評分［8］:0分:沒有運動改變，正常的行走;1分:輕度運動功能減弱，對足底的刺激縮爪反應(yīng)正常;2分:自主活動減弱，中度運動功能減弱，正常行走，對足底的刺激有縮爪反應(yīng)，但減弱;3分:不能自主活動，不能行走，對足底的刺激沒反應(yīng)。評分≥2，表示有明顯的運動功能障礙。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 大鼠在戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉下行左心室穿刺灌注，取腰段脊髓，4%多聚甲醛后固定。行連續(xù)冰凍切片，切片厚度為40 μm，每間隔5張取1張，收集在0.01 mol·L－1PBS液中。切片沖洗孵育后，加入GAT-1一抗(1∶300)。4℃孵育48 h后用PBS洗去未結(jié)合的一抗，順序加入工作液。以上各步驟均用0.01 mol·L－1PBS徹底漂洗切片，最后用即用型DAB顯色，干燥，脫水，透明，中性樹膠封片。每只動物隨機取脊髓片3張，高倍鏡下以O(shè)lympus DP11數(shù)碼相機在脊髓背角截取一屏，以Leica圖像分析系統(tǒng)對上述部位GAT-1的染色灰度進行分析。

1.6 Western blot 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腰段脊髓放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。提取胞膜蛋白，?0 μg蛋白樣本SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，與GAT-1一抗(1∶300)孵育過夜，加入兔二抗(1∶500)，孵育沖洗，用NBT/BCIP進行呈色反應(yīng)，反應(yīng)條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

各組大鼠基礎(chǔ) MWT分別為:(13.2±1.7)g、(12.9±1.9)g、(13.5±1.4)g、(13.4 ±1.5)g;基礎(chǔ)TWL分別為:(14.2±3.9)s、(15.4±4.0)s、(16.1±3.8)s、(15.5 ±4.3)s。坐骨神經(jīng)結(jié)扎后 d 3，各組大鼠的MWT分別降低為:(4.2±2.1)g、(4.9±2.7)g、(4.5±1.7)g、(4.5±1.7)g;TWL 分別縮短為:(6.8 ±2.4)s、(6.6 ±1.6)s、(7.4 ±1.9)s、(7.42±2.7)s;均明顯低于各自的基礎(chǔ)值(P＜0.01)。

2.1 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)松結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠MWT和TWL的影響 鞘內(nèi)分別注射0.1、0.3、1 μg 巴氯酚后0.5 ～2 h，Bac1 組、Bac2 組與Bac3組大鼠MWT和TWL均較NS組明顯升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，鞘內(nèi)給藥后4 h，Bac2與 Bac3組大鼠MWT和TWL仍較 NS組明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，但Bac1組與NS組相比無差別(P＞0.05)，給藥后 8 h，Bac1組與 Bac2組 MWT與TWL均降至給藥前水平，但Bac3組MWT與TWL仍高于NS組(P＞0.05)。見Tab 1，2。

2.2 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠運動功能的影響 鞘內(nèi)分別注射0.03、0.3 μg巴氯酚后，大鼠均能保持自主活動，對足底的刺激反應(yīng)靈敏，運動功能評分均為0或1。鞘內(nèi)注射1 μg巴氯酚后，在該實驗組的8只動物中有5只大鼠出現(xiàn)不同程度的自主運動障礙，運動功能評分均≥2，持續(xù)時間約為15～30 min。

2.3 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角GAT-1免疫陽性神經(jīng)元的影響

與NS組比較，鞘內(nèi)注射0.3μg巴氯酚后1、4 h，大鼠脊髓背角淺層GAT-1免疫陽性染色灰度值明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);給藥后8 h，Bac組脊髓背角淺層GAT-1染色灰度雖然降低，但與NS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 in spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(×100)

2.4 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓GAT-1蛋白含量的影響 與NS組和給藥前比較，鞘內(nèi)注射0.3 μg巴氯酚后0.5～4 h，大鼠脊髓節(jié)段的GAT-1蛋白含量均明顯降低(P＜0.01，P ＜0.05)，至給藥后 8 h，GAT-1 的表達逐漸增多，與NS組和給藥前相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見Tab 3。

3 討論

目前認為，巴氯酚可激活突觸前GABAB受體使背根節(jié)C及Aδ纖維傳入神經(jīng)動作電位時程縮短，Ca2+電流減小，復(fù)極化過程加快，一方面可抑制致痛物質(zhì)，如P物質(zhì)、谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放;另一方面，巴氯酚可促進抑制疼痛信息傳遞的遞質(zhì)如GABA、內(nèi)啡肽的釋放。但目前還不清楚巴氯酚促進GABA釋放的機制。

Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g，ˉ±s，n=8)

Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g，ˉ±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs the baseline values

0.5 1 2 4 8 12 24 NS 4.2 ±2.1 5.9 ±2.8 5.1 ±1.2 3.9 ±2.0 4.1 ±2.4 4.Group Baseline Post-injection/h 4 ±1.8 4.2 ±1.2 4.0 ±1.9 Bac1 4.9 ±2.6 13.2 ±2.6＊＊## 12.3 ±3.8＊＊## 8.1 ±3.3＊＊# 4.9 ±1.7 3.2 ±0.8 4.0 ±2.1 3.3 ±2.4 Bac2 4.5 ±1.7 13.5 ±2.3＊＊## 12.9 ±4.5＊＊## 11.4 ±3.2＊＊## 7.1 ±2.2*# 5.2 ±1.1 5.2 ±1.3 4.8 ±1.3 Bac3 4.5 ±1.9 12.3 ±2.2＊＊## 12.4 ±1.8＊＊## 12.8 ±2.0＊＊## 8.3 ±3.5*# 7.8 ±2.7＊＊#5.9 ±1.1 3.8 ±2.2

Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s，n=8)

Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs the baseline values

24 NS 6.8 ±2.4 5.2 ±2.2 7.1 ±1.5 6.4 ±2.5 7.3 ±2.7 6.Group Baseline Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 3 ±1.9 6.8 ±1.3 7.7 ±2.5 Bac1 6.5 ±1.6 18.2 ±4.2＊＊## 11.67 ±3.7＊＊## 9.1 ±1.8*## 6.4 ±2.2 5.7 ±1.5 6.2 ±2.6 6.9 ±2.2 Bac2 7.4 ±1.9 17.5 ±4.0＊＊## 18.2 ±5.3＊＊## 15.9 ±3.8＊＊## 10.9 ±2.8*# 7.0 ±1.8 7.4 ±1.5 6.5 ±1.6 Bac3 7.4 ±2.7 16.8 ±3.7＊＊## 17.9 ±4.8＊＊## 16.6 ±4.2＊＊## 13.6 ±3.3＊＊##10.8 ±2.3＊＊#8.6 ±1.9 6.6 ±3.1

Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline，ˉ ± s，n=4)

Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline，ˉ ± s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs NS group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs the baseline values;##P＜0.01 vs Pre-injection values

Group Baseline Pre-injection Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 24 NS 100±0 179±29△△ 172±18△△ 165±23△△ 181±35△△ 175±26△△ 168±27△△ 174±25△△ 169±24△△Bac 103±24 182±31△△ 116±17＊＊##95±16＊＊## 107±19＊＊##100±23＊＊## 149±21△ 159±26△ 165±30△

本實驗在坐骨神經(jīng)結(jié)扎致痛覺過敏大鼠鞘內(nèi)給予巴氯酚，能抑制大鼠的觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的持續(xù)時間隨劑量的增加而延長，0.3 μg巴氯酚可提供至少4 h的鎮(zhèn)痛。在本實驗所用的三個劑量中，1.0 μg的巴氯酚雖然鎮(zhèn)痛效應(yīng)持續(xù)時間較其它兩個劑量的作用時間長，但是其對大鼠的運動功能影響較大。在該實驗組中，部分大鼠的運動功能評分≥2，出現(xiàn)了不同程度的自主運動障礙和對足底刺激反應(yīng)降低，表明大劑量的GABAB受體激動劑對大鼠的運動功能有一定影響，這也是GABAB受體激動劑用于臨床鎮(zhèn)痛受限制的原因之一。

在本實驗中，鞘內(nèi)給予0.3 μg巴氯酚后，大鼠脊髓背角淺層GAT-1樣免疫陽性染色灰度明顯降低，表明GAT-1的表達明顯減少，且與NS組及給藥前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。0.3μg巴氯酚使GAT-1表達減少的效應(yīng)持續(xù)至給藥后4 h，至給藥后8 h，脊髓背角淺層GAT-1的表達逐漸升高，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與該劑量在神經(jīng)病理性痛大鼠模型上的鎮(zhèn)痛效應(yīng)持續(xù)時間是一致的，提示鞘內(nèi)注射巴氯酚可能通過調(diào)節(jié)脊髓水平GAT-1的表達來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)［9］，GAT可與鈣/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ以及谷氨酸脫羧酶(GAD)形成復(fù)合體，共同調(diào)節(jié)GABA的合成與釋放。Kang等［10］研究證實，在沙土鼠的海馬，GABAB受體的激活可使囊泡GABA轉(zhuǎn)運體(VGAT)減少，減少突觸前GABA的釋放，增加突觸間隙GABA的含量。因此推測在本實驗中，巴氯酚可能通過激活了突觸前的自身 GABAB受體，使脊髓背角GAT-1的含量降低，減少GABA的重攝取，進而增加突觸間隙GABA的含量，從而抑制疼痛信息的傳遞。

綜上所述，鞘內(nèi)注射GABAB受體激動劑巴氯酚可減輕坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠的痛覺過敏，其鎮(zhèn)痛作用可能與抑制脊髓水平GABA轉(zhuǎn)運體-1的表達有關(guān)。

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