苦參堿類化合物的密度泛函計(jì)算與抗乙型肝炎病毒活性分析

王春露，龍偉，劉培勛

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所、天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

苦參堿型生物堿［1］是以苦參堿為代表的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一類生物堿，廣泛存在于豆科植物苦參(S．flavescens Ait)、苦豆子(S．a(chǎn)lpecuroides L.)及廣豆根(S．subprostrata Chun et T.Chen)中，是這幾種常用中草藥的主要有效成分?？鄥A是苦參堿型生物堿的代表，屬于四環(huán)的喹喏里西定(quinolizidine)生物堿，分子骨架可以看作是兩個喹嗪啶環(huán)的雜體，一般含有3或4個手性中心，結(jié)構(gòu)非常相似(圖1和表1)。在這些生物堿中，有的區(qū)別僅僅在于環(huán)結(jié)合部位碳原子的手 性［2-3］(如 allomatrine［4］， 5;sophoridine， 和darvasamine);另外一些則含有一到多個分子內(nèi)雙鍵(如 lehmannine［5］，4)或者羥基(sophoranol或者 5αhydroxymatrine，3)［6］。

近年來，隨著對其藥理作用研究的深入和擴(kuò)展，人們發(fā)現(xiàn)苦參堿具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、穩(wěn)定神經(jīng)等中樞神經(jīng)作用;防止動脈粥樣硬化、減輕心肌損傷等心血管系統(tǒng)作用;抗肝損傷、抗纖維化、升高白細(xì)胞等消化系統(tǒng)作用;還具有抗腫瘤、抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。因此，對苦參堿的研究已日益受到人們的關(guān)注［6-7］。

筆者用密度泛函方法(density functional theory，DFT)［8］，計(jì)算了表1中10種苦參堿類化合物的三維結(jié)構(gòu)，得到了它們的結(jié)構(gòu)信息。在此基礎(chǔ)上，利用啟發(fā)式算法(heuristicmethod，HM)對這些化合物抗HBV的活性與其量子化學(xué)參數(shù)之間進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)研究，得到了苦參堿類化合物的結(jié)構(gòu)-活性模型。

1 理論研究方法

首先用半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)方法(AM1)對10種苦參堿類化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)初步的三維結(jié)構(gòu)優(yōu)化，找出低能量的構(gòu)象，然后用密度泛函B3LYP/6-311+G(d，p)方法對上述結(jié)構(gòu)再次進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行自然軌道布局分析。同時(shí)，進(jìn)行頻率分析，由所得結(jié)構(gòu)不出現(xiàn)虛頻，確定其幾何構(gòu)型為穩(wěn)定構(gòu)型，從而得到化合物分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的幾何參數(shù)。計(jì)算使用Gaussian 03程序(Frisch M J，Trucks GW，Schlegel H B，et al.Gaussian 03.Revision A.01.Pittsburgh，PA:Gaussian Inc.，2003)。利 用CODESSA(Comprehensive Descriptors for Structural and Statistical Analysis，Reference Manual，Version 2.7.10.)程序，將量子化學(xué)方法得到的能量和結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，得到5類描述符:構(gòu)成描述符、拓?fù)涿枋龇?、幾何描述符、靜電描述符和量子化學(xué)描述符。CODESSA程序中的HM可對大量的分子描述符進(jìn)行完全搜索，建立最佳的線性回歸方程。

筆者采用的活性數(shù)據(jù)參考了文獻(xiàn)［6］，在濃度為0.2μmol·mL-1時(shí)體外HBsAg分泌抑制率。

2 計(jì)算結(jié)果與分析

2.1 密度泛函計(jì)算結(jié)果分析 計(jì)算所得到的部分結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)、能級和原子電荷列于表2中。為了進(jìn)行比較，半經(jīng)驗(yàn)方法AM1計(jì)算所得到的相應(yīng)參數(shù)也列于表2中。

比較密度泛函方法以及半經(jīng)驗(yàn)方法計(jì)算所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者在結(jié)構(gòu)參數(shù)方面差別不大，但是當(dāng)涉及到分子軌道能級以及原子電荷的計(jì)算時(shí)，二者有較大的差別。例如在氧化苦參堿原子電荷的計(jì)算中，N1位氧化后半經(jīng)驗(yàn)方法計(jì)算所得結(jié)果為正，而用密度泛函方法所得結(jié)果為負(fù)。由于DFT方法考慮了電子相關(guān)效應(yīng)，其計(jì)算精度相對較高;并且在QSAR研究中分子軌道能級和原子電荷兩類參數(shù)用得最多，因此只能以較為精確、近似程度較少的密度泛函方法為準(zhǔn)［9-10］。

活性結(jié)果文獻(xiàn)中給出了部分該類化合物構(gòu)效關(guān)系的歸納概括，通過結(jié)合密度泛函計(jì)算結(jié)果對其解釋如下:當(dāng)苦參堿結(jié)構(gòu)中D環(huán)存在有雙鍵(12-13位或者13-14位)時(shí)活性增強(qiáng)，C14位羥基的引入則削弱該種作用。經(jīng)分析得知，D環(huán)引入雙鍵之后，由于雙鍵π電子的作用13位C原子上的凈電荷由-0.211(1)降低為-0.087(3)、-0.097(4)、-0.087(8)、-0.093(9)、-0.087(10);對于化合物6，存在雙鍵α位羥基的吸電子作用，13位C原子電負(fù)性進(jìn)一步降低(-0.027)?？梢哉J(rèn)為，13位C原子上的凈電荷與苦參堿類化合物的抗HBV活性密切相關(guān)，當(dāng)C13上的凈電荷范圍為-0.087至-0.097時(shí)，化合物顯示出了較強(qiáng)的抗HBV活性，偏離這個范圍則會影響到此類化合物的活性。

對槐果堿(3)引入N-O鍵(8)或者羥基(6和10)均會降低其活性。對于槐果堿結(jié)構(gòu)，在N1、C9或者C12位引入氧原子后，分子的分子表面積發(fā)生了變化(表3)，并且與實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出了較好的負(fù)線性相關(guān)(r2=0.836)。此類化合物分子的分子表面積對活性影響較大，提示其作用靶點(diǎn)的結(jié)合腔可能較小或者為剛性結(jié)構(gòu)。關(guān)于這一點(diǎn)在HM結(jié)果分析中會做進(jìn)一步的討論。

對于苦參母核的結(jié)構(gòu)(D環(huán)飽和，如1)，引入N-O鍵(2)或者羥基(7)會增強(qiáng)其活性?；衔?，2，7計(jì)算結(jié)果中的偶極矩(Dipole)分別為4.021 9，5.635 5，4.397 7，與其抗HBV活性展現(xiàn)出了良好的線性相關(guān)?？鄥⒛负藶樗沫h(huán)喹喏里西定結(jié)構(gòu)，分子中有4個六元環(huán)，分子疏水性較強(qiáng)。在B環(huán)N原子或9位C原子上引入氧原子后，雖未對分子的最低能量構(gòu)象產(chǎn)生較大的影響，但是分子的偶極矩發(fā)生了變化，同時(shí)其空間立體作用和電性作用得到了增強(qiáng)，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

表3 幾種化合物的分子表面積與其抗HBV活性的關(guān)系Tab．3 Relationship of molecular surface area of several compounds and their anti-HBV activity

對比化合物7與10發(fā)現(xiàn)，在羥基苦參堿結(jié)構(gòu)中引入13-14位雙鍵對活性不利。通過對于化合物7與10計(jì)算結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，在13-14位引入與雙鍵，可以與酰胺鍵產(chǎn)生共軛效應(yīng)。受該體系的影響，LUMO軌道范圍擴(kuò)大到整個D環(huán)，同時(shí)由于這種電子效應(yīng)的存在，價(jià)電子變得分散，作為苦參堿結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)之一的內(nèi)酰胺鍵趨于穩(wěn)定，不易斷裂;酰胺鍵電子離域效應(yīng)增加，影響了分子的構(gòu)型和構(gòu)象(C14-C15單鍵縮短、C13-C14雙鍵增長、原子保持共平面等)、分子的電性等，這就解釋了在羥基苦參堿結(jié)構(gòu)中引入13-14位雙鍵對活性不利。

2.2 HM計(jì)算結(jié)果分析 CODESSA軟件中的啟發(fā)式方法可對大量的分子描述符進(jìn)行完全搜索，從而建立最佳的線性回歸方程。該方法首先對分子描述符進(jìn)行共線性控制，如任意兩個相關(guān)系數(shù)＞0.8的描述符不會同時(shí)包含在同一個模型中，并采用啟發(fā)式算法對參數(shù)進(jìn)行快速篩選建立最佳的模型，而不是考察所有可能的參數(shù)組合。啟發(fā)式方法采用預(yù)處理的方式，根據(jù)以下4條規(guī)則排除掉一些描述符，①不是每個化合物都共有的參數(shù);②對所有化合物來說，數(shù)值變化較小的描述符;③在一個參數(shù)相關(guān)方程中，F(xiàn)檢驗(yàn)值＜1.0的參數(shù);④t檢驗(yàn)值小于某一定義值的描述符。啟發(fā)式回歸方法將分子描述符按一個參數(shù)模型的相關(guān)系數(shù)降序排列，每次引入剩余描述符中與所研究性質(zhì)相關(guān)系數(shù)最大的描述符，依次下去。模型的好壞由相關(guān)系數(shù)(R2)、F檢驗(yàn)值(F)以及標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)等來檢驗(yàn)。模型的穩(wěn)定性用留一法(leave-one-out，LOO)交互檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)2Rcv來檢驗(yàn)。簡單來說，首先去除數(shù)據(jù)集中的一個樣本，用相同的參數(shù)重新建立模型預(yù)測去除的樣本，依次下去，直到數(shù)據(jù)集中每一個樣本都被去除和預(yù)測一次，求出預(yù)測值和試驗(yàn)值的相關(guān)系數(shù)即得到2Rcv。一般地，啟發(fā)式回歸方法速度快而且所建立的模型質(zhì)量也較高［11-12］，這種優(yōu)點(diǎn)使得啟發(fā)式回歸成為實(shí)際應(yīng)用中的首要選擇。

每個分子用CODESSA可以計(jì)算出500～600個描述符，計(jì)算出分子的組成、拓?fù)洹缀?、電子和量子化參?shù)。組成參數(shù)反映了分子的組成信息，主要包括分子中原子、鍵、環(huán)等的數(shù)目以及分子量等;拓?fù)鋮?shù)描述了分子中原子的連接信息，主要包括Wiener指數(shù)、Randic指數(shù)以及Kier-Hall形狀指數(shù)等;幾何參數(shù)描述了分子的大小和形狀，主要包括慣性矩、分子體積和表面積等;靜電參數(shù)描述了分子中電荷的分布信息，主要包括最大和最小偏電荷、極性以及電荷加權(quán)的分子表面積參數(shù)(CPSA)等;量化參數(shù)主要反映了分子中的電荷分布以及分子軌道能量等信息，對分子的反應(yīng)和分子之間的靜電相互作用以及分子軌道之間的相互作用都有重要的影響，量化參數(shù)主要包括反應(yīng)指數(shù)、偶極矩、HOMO以及LUMO能量等。

密度泛函計(jì)算之后，將結(jié)果導(dǎo)入CODESSA軟件中，共計(jì)算了165個描述符，并使用啟發(fā)式算法對165個描述符進(jìn)行挑選，發(fā)現(xiàn)其中兩個描述符:分子表面面積(MSA)，XY軸面投影(Sxy)與HBsAg分泌抑制率密切相關(guān)，利用多元線性回歸方法，對這兩個描述符與抑制率進(jìn)行回歸，得到方程:IR=-0.155-0.023 MSA+0.078 Sxy(r=0.82，q=0.72)。

從方程中可以看出，苦參堿類化合物抑制HBV的活性與分子的立體構(gòu)型密切相關(guān)。其中，抑制活性與分子表面面積呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這說明苦參堿類化合物分子構(gòu)型應(yīng)盡量避免扭曲程度過大，扭曲增大將導(dǎo)致分子表面擴(kuò)張，而使其抗HBV的活性減弱。XY軸面投影是一個幾何描述指數(shù)，指的是分子在立體空間中投影在XY軸面的陰影面積，這個指數(shù)反映的是分子的形體大小和松散度。從方程中可以看出，苦參堿類化合物的HBV抑制活性與這個指數(shù)是正性相關(guān)，也就是說分子的松散度越高，其抑制活性越高。

3 討論

采用DFT對10種苦參堿類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了計(jì)算，并對其抗HBV活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，分子的偶極矩、分子表面積、酰胺鍵的穩(wěn)定性以及13位C原子上的凈電荷是影響該類化合物抗HBV活性的重要因素。

苦參堿類化合物是一類具有良好開發(fā)前景的天然產(chǎn)物。為了更好地開發(fā)和利用中藥，對其主要活性成分進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究十分必要。筆者利用密度泛函(DFT)方法，對10種化合物的電子結(jié)構(gòu)、分子軌道能級以及原子電荷進(jìn)行了較為準(zhǔn)確的分析，對于實(shí)體實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論進(jìn)行了解釋，計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到了較好的吻合。

(志謝:感謝天津藥物研究院徐為人教授在化學(xué)計(jì)算方面的指導(dǎo)，感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院高性能計(jì)算中心的支持!)

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