益腎健骨膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

梁山丹，陳曉軍，粟華生，榮燕李，黃園，莫少紅

(廣西匯科藥物研究有限責(zé)任公司，南寧 530007)

益腎健骨膠囊系由千年健、制何首烏、丹參、淫羊藿、三七、人參、女貞子等藥味按規(guī)定方法制成，具有補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血、化瘀通絡(luò)之功效，用于肝腎不足、氣虛血瘀所致的慢性腰腿痛，肢體疼痛，麻木［1］。原劑型質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別方法［1-2］操作步驟繁瑣，生產(chǎn)檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，筆者對(duì)其進(jìn)行了修訂，并增加了丹參的薄層色譜鑒別。本品原劑型用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定齊墩果酸的含量［1，3］，齊墩果酸有抗炎、增強(qiáng)免疫、抑制血小板、降糖的作用，主要用于肝炎、高脂血癥等，本品中齊墩果酸含量較低，而淫羊藿苷具有促進(jìn)免疫功能［4］、參與骨代謝［5］、補(bǔ)腎壯陽［6］等作用，與本品功能主治一致，故取消齊墩果酸的含量測(cè)定，選取淫羊藿苷作為含量測(cè)定指標(biāo)成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-2010A高效液相色譜儀，島津LCsolotion色譜工作站，島津UV-2450分光光度計(jì)。

1.2 試藥 大黃素對(duì)照品(批號(hào):0756-9707)、甘草次酸對(duì)照品(批號(hào):110723-200411)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào):110737-200312)、人參皂苷 Rg1對(duì)照品(批號(hào):110703-200322)、丹參對(duì)照藥材(批號(hào):120923-200408)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純)，流動(dòng)相用水為自制雙蒸水，其他試劑均為分析純;益腎健骨膠囊及陰性對(duì)照樣品均由廣西博科藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃素、甘草次酸薄層色譜鑒別 取本品內(nèi)容物7 g，加二氯甲烷 40 mL、鹽酸 4 mL，加熱回流 1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%氫氧化鈉溶液30 mL使溶解，用棉花濾過，濾液用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，棄去二氯甲烷提取液，水溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，再用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺制何首烏、巴戟天陰性對(duì)照樣品，同法制成缺制何首烏、巴戟天的陰性對(duì)照溶液;取缺甘草陰性對(duì)照樣品，同法制成缺甘草陰性對(duì)照溶液。另取大黃素、甘草次酸對(duì)照品，分別加乙醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5～10μL，上述兩種對(duì)照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(18∶2∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長(zhǎng)254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與甘草次酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的暗斑。置紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)及日光下檢視，供試品色譜中，在與大黃素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，陰性對(duì)照無干擾。見圖1。視;C.氨薰后，日光下檢視;1.缺甘草陰性樣品;2.甘草次酸對(duì)照品;3～5.益腎健骨膠囊;6.大黃素對(duì)照品;7.缺制何首烏、巴戟天陰性樣品

圖1 何首烏、巴戟天、甘草薄層色譜圖A.紫外光燈(254 nm)下檢視;B.紫外光燈(365 nm)下檢

2.2 丹參薄層色譜鑒別 取本品內(nèi)容物10 g，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%硫酸溶液30 mL使溶解，用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，棄去二氯甲烷提取液，水溶液用水飽和的正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用5%碳酸鈉溶液提取2次，每次30 mL，正丁醇液留用，合并碳酸鈉液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺丹參陰性對(duì)照樣品，同法制成缺丹參陰性對(duì)照溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL、對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(10∶2∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。見圖2。

圖2 丹參薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.丹參對(duì)照藥材;5.缺丹參陰性樣品

2.3 淫羊藿苷薄層色譜鑒別 取“2.2”項(xiàng)下的正丁醇液，用水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺淫羊藿陰性對(duì)照樣品，同法制成缺淫羊藿陰性對(duì)照溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含0.25 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。見圖3。

2.4 人參皂苷Rg1薄層色譜鑒別 取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，加中性氧化鋁1 g，拌勻，蒸干，加于中性氧化鋁柱(內(nèi)徑9 mm，干法裝柱)上，用40%甲醇溶液80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺人參、三七陰性對(duì)照樣品，同法制成缺人參、三七的陰性對(duì)照溶液。另取人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5～10μL、對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。見圖4。

圖3 淫羊藿薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.淫羊藿苷對(duì)照品;5.缺淫羊藿陰性樣品

圖4 人參、三七薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.人參皂苷Rg1對(duì)照品;5.缺人參、三七陰性樣品

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(島津VP-ODS柱，150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(27∶73);流速:1.0 mL·min-1，柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm;進(jìn)樣量:10μL。此條件下供試品色譜中淫羊藿苷與其他組分達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算＞6 000，淫羊藿苷保留時(shí)間約13 min，陰性無干擾。見圖5。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含50μg的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率260 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖5 3種樣品HPLC圖A.陰性樣品;B.淫羊藿苷對(duì)照組;C.益腎健骨膠囊樣品;1.淫羊藿苷

2.5.4 陰性樣品溶液的制備 取缺淫羊藿的陰性樣品1.0 g，同“2.5.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密量取1.041 mg·mL-1淫羊藿苷對(duì)照品溶液 0.1，0.3，0.5，1.0，1.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.010 41，0.031 23，0.052 05，0.104 10，0.156 15 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10μL，以峰面積(A)對(duì)淫羊藿苷進(jìn)樣量(C，μg)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程:A=2 069 905C+6 401，r=0.999 9。表明淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.104 1～1.561 5μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

2.5.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取52.05μg·mL-1淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。RSD為0.32%，儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在放置0，2，4，6，8，24，48，72 h 后進(jìn)樣測(cè)定，其日內(nèi) RSD 為1.09%，日間RSD為1.29%，表明穩(wěn)定性較好。

2.5.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算淫羊藿苷的含量為每粒0.706 mg，RSD為1.57%，表明方法重復(fù)性較好。

2.5.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的樣品(批號(hào):20070401)0.3 g，共6份，精密稱定，再分別精密加入1.041 mg·mL-1的淫羊藿苷對(duì)照品溶液0.5 mL，揮干溶劑，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率98.76%，RSD=1.63%，見表1，表明方法回收率較好。

2.5.10 樣品測(cè)定 按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定3批樣品，以峰面積按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表2。

表1 淫羊藿苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在大黃素的薄層色譜鑒別研究中發(fā)現(xiàn)，原劑型方法“加二氯甲烷100 mL，超聲處理10 min”的處理可將部分大黃素提取出來而導(dǎo)致供試品色譜斑點(diǎn)減弱，本方法簡(jiǎn)化了操作步驟，且同樣能同時(shí)鑒別大黃素、甘草次酸、齊墩果酸。本方法展開系統(tǒng)分離效果好，能同時(shí)鑒別兩種成分，故選用。

在丹參的薄層色譜鑒別中，試用了較多提取方法，結(jié)果供試品色譜中雜質(zhì)均較多，分離效果不好，而本法雜質(zhì)少，特征斑點(diǎn)清晰，且可與“2.3”項(xiàng)下供試品溶液一起提取。

在淫羊藿苷的薄層色譜鑒別中，對(duì)比了原劑型提取方法，結(jié)果供試品色譜中，雜質(zhì)較多而本法淫羊藿苷特征斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)較少，操作步驟較原劑型方法簡(jiǎn)單。另試用了不同的展開系統(tǒng):①三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶1)的下層溶液，展距9 cm，二次展開(為原劑型方法);②正丁醇-乙醇-甲酸-水(12∶2∶0.5∶2.5)，等。結(jié)果方法①分離效果不好，陰性有雜質(zhì)斑點(diǎn)干擾;方法②比移值偏大，邊緣效應(yīng)大，以正文收載系統(tǒng)分離效果較好，比移值適中。

在人參皂苷Rg1的薄層色譜鑒別中，原劑型提取方法供試品色譜斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)少，但操作步驟繁瑣，而本法操作步驟較原劑型方法簡(jiǎn)單，斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)干擾少。展開系統(tǒng)選用《中華人民共和國(guó)藥典》鑒別人參皂苷Rg1方法［7］，操作較簡(jiǎn)便，分離效果好，比移值適中。

實(shí)驗(yàn)中參考文獻(xiàn)［8-11］對(duì)淫羊藿苷進(jìn)行含量測(cè)定。另考察了供試品提取方法，淫羊藿苷為黃酮醇苷類化合物，易溶于甲醇、乙醇、水等溶劑，故考察提取溶劑甲醇及稀乙醇，結(jié)果以甲醇提取雜質(zhì)少，峰形好。同時(shí)還考察了加熱回流時(shí)間(0.5，1.0，1.5 h)，超聲處理時(shí)間(15，30，60 min)，超聲處理30 min 即可提取完全。［DOI］ 10.3870/yydb.2011.06.039

［1］ 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編·骨傷科(第11分冊(cè))［S］.2004:308-311.

［2］ 李忠瓊，張?chǎng)?，馬昕，等.益腎健骨片的薄層色譜鑒別研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15(9):591-592.

［3］ 李忠瓊，張?chǎng)?，馬昕，等.高效液相色譜法測(cè)定益腎健骨片中齊墩果酸的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15(7):397-398.

［4］ LIU TH，WANG B X，WANG Y，et al.Effect of icariin and itsmetabolites on the production of cytokines by THP-lcells［J］.Acta Pharm Sinica，2000，35(4)，245-250.

［5］ 殷曉雪，陳仲?gòu)?qiáng)，黨耕町，等.淫羊藿苷對(duì)人成骨細(xì)胞增殖與分化的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(4):289-291.

［6］ 秦路平，石漢平，鄭水慶，等.蛇床子素和淫羊藿苷對(duì)甲甲狀腺功能減退小鼠血清甲狀腺激素的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19(1):48-50.

［7］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:10.

［8］ 于洋，李倚云.補(bǔ)腎強(qiáng)身膠囊標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(1):9-10.

［9］ 劉曉琳，顏曉航.高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定抗骨增生顆粒中淫羊藿苷的含量［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17(4):48-50.

［10］ 王波.舒心片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中藥材，2002，25(8):591-592.

［11］ 莫炫永.對(duì)藤黃健骨丸中淫羊藿苷的含量測(cè)定的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2007，5(5):38-40.