西紅花酸對大鼠腦缺血-再灌注氧自由基及一氧化氮的影響*

譚安雄，朱耀斌，王玉銀

(1.邵陽醫(yī)學高等專科學校藥學系，湖南邵陽 422000;2.湖南交通醫(yī)院藥劑科，長沙 410006;3.中南大學湘雅二醫(yī)院，長沙 410011)

西紅花酸(crocetin)是西紅花的主要有效成分之一，具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu)，屬類胡蘿卜素物質(zhì)。國內(nèi)外文獻［1-3］報道西紅花酸具有抗動脈粥樣硬化、改善糖尿病血管病變、抗凝血和抗血栓等作用，對心肌缺血損傷有保護作用。西紅花酸對心肌缺血損傷有保護作用，筆者推測其對缺血性腦血管疾病也有一定作用，觀察西紅花酸對腦缺血-再灌注損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量260～320 g，購自中科院上海實驗動物中心，動物合格證:SCXK(滬)200920056。

1.2 藥物及試劑 西紅花酸(廣州佳科生物科技有限公司產(chǎn)品，批號:09031210，規(guī)格:每支10 mg);尼莫地平(山東濰坊制藥有限公司產(chǎn)品，批號:090218，規(guī)格:每支5 mg)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)，北京化學試劑公司生產(chǎn)。

1.3 動物分組與給藥 120只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機分成6組，即假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(分別給予尼莫地平溶液5 mg·kg-1)及低、中、高劑量藥物組(給予西紅花酸10，20，40 mg·kg-1)，每組20只。假手術(shù)組、模型組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠均于每日上午灌胃給予0.9%氯化鈉溶液或相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥7次。

1.4 大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的制備 末次給藥1 h后，參照文獻［4］，制備大鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型。用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，消毒皮膚，頸部正中切開，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。沿頸內(nèi)動脈向下分離出翼腭動脈，并結(jié)扎。用動脈夾夾閉頸總動脈，于頸外動脈上距其始端約2 mm處剪一切口，將一端燙圓的魚線沿頸外動脈緩慢插入至大腦中動脈起始端，略感阻力時停止，插入長度18～22 mm。阻斷中動脈2 h，輕輕拔出魚線至頸外動脈處，使大腦中動脈恢復供血，再灌注22 h。假手術(shù)組大鼠分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈及翼腭動脈，結(jié)扎翼腭動脈，但不插魚線阻斷大腦中動脈。

1.5 神經(jīng)損傷癥狀評分 再灌注22 h，每組取10只大鼠。采用ZeaLonga評分法進行神經(jīng)功能缺陷評分。0分:未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀，活動正常;1分:不能完全伸展手術(shù)對側(cè)前肢;2分:爬行時出現(xiàn)向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時身體向手術(shù)對側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，昏迷;5分:死亡。

1.6 腦梗死體積比例測定 神經(jīng)功能行為缺陷評分后將大鼠斷頭取出全腦，取缺血側(cè)大腦，去除小腦、低位腦干和嗅球，將右腦沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片置于2%TTC溶液2mL中避光孵育30 min。再將腦片置10%甲醛中固定。數(shù)碼相機攝相后，應(yīng)用圖像分析儀，測量腦梗死體積比例。

1.7 缺血腦組織中MDA和NO的含量、SOD活性測定 再灌注22 h后，每組取大鼠10只，斷頭處死，取缺血側(cè)皮質(zhì)組織，用0.9%氯化鈉溶液制備10%腦組織勻漿。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定大腦組織中MDA、NO的含量及SOD活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 西紅花酸對大鼠神經(jīng)癥狀的影響 假手術(shù)組無神經(jīng)癥狀，模型組有明顯神經(jīng)癥狀，西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠神經(jīng)缺陷評分，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)，見表1。

2.2 西紅花酸對缺血-再灌注大鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較模型組大鼠腦梗死范圍明顯(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平明顯降低大鼠腦梗死范圍，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

表1 6組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.01Compared with the model group，*1 P ＜ 0.01，*2 P ＜ 0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)神經(jīng)功能缺陷評分/分腦梗死體積比例/%西紅花酸高劑量藥物組 40 0.35±0.31*1 13.2±4.3*1中劑量藥物組 20 1.21±0.54*2 21.6±3.5*2低劑量藥物組 10 2.04±0.32 34.2±2.7尼莫地平組 5 1.29±0.42*2 20.6±4.2*2假手術(shù)組 … 0.00±0.00 0.0±0.0模型組 … 2.12±0.64*3 44.8±3.2*3

2.3 西紅花酸對大鼠缺血腦組織MDA、NO含量的影響 模型組大鼠腦內(nèi)MDA、NO明顯增多，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠腦內(nèi)MDA、NO含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

2.4 西紅花酸對大鼠缺血腦組織SOD活性的影響模型組大鼠腦組織SOD活性與假手術(shù)組比較明顯降低(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯增加大鼠腦內(nèi)SOD活性，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)大鼠/只MDA NO μmol·g-1 SOD/(kU·g-1)西紅花酸高劑量藥物組 40 10 2.0±0.5*1 5.8±1.5*1 198.3±13.1*1中劑量藥物組 20 10 2.9±0.4*2 8.8±1.3*2 159.8±10.9*2低劑量藥物組 10 10 3.8±0.7 10.8±2.3 132.4±12.1尼莫地平組 5 10 2.5±0.8*3 8.8±2.1*3 164.3±10.7*3假手術(shù)組 … 10 2.1±0.6 6.3±1.1 202.6±12.5模型組 … 10 4.2±0.7*3 12.8±1.3*2 121.1±11.6*2

3 討論

腦缺血-再灌注損傷的機制十分復雜，目前的研究表明其涉及興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基毒性、炎性損傷及凋亡的表達等，其中氧自由基在腦缺血-再灌注損傷中占有重要地位。腦缺血-再灌注所產(chǎn)生氧自由基通過作用于細胞膜上不飽和脂肪酸，使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使質(zhì)膜破壞和功能障礙;氧自由基可使蛋白質(zhì)的巰基氧化，形成二硫鍵，直接損傷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，抑制蛋白質(zhì)的功能;氧自由基還可使DNA斷裂，破壞核酸及染色體的結(jié)構(gòu)和功能。

腦缺血-再灌注后，大量的氧分子為黃嘌呤氧化酶的核苷酸代謝提供了底物，導致過氧化氫和超氧化物過量產(chǎn)生，自由基清除酶活性降低，消除自由基的功能減弱，使自由基與清除自由基酶之間的平衡失調(diào)。MDA是脂質(zhì)過氧化物中的主要產(chǎn)物，測定MDA可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。SOD為抗氧化酶，是體內(nèi)主要的自由基清除劑，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，保護細胞免受損傷。SOD活力的高低反應(yīng)機體清除氧自由基的能力，常作為清除氧自由基能力的主要指標。因此，通過測定SOD、MDA可反映腦缺血-再灌注后自由基對腦組織的損傷情況［5］。

NO在腦缺血發(fā)病過程中有雙重作用［6］。缺血早期血管內(nèi)皮細胞中的結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)介導產(chǎn)生少量的NO，可擴張血管和抑制血小板聚集，改善腦組織灌流，對缺血腦組織有保護作用。再灌注時，神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)介導產(chǎn)生大量的NO則具有神經(jīng)毒性，可直接或者通過其衍生物導致能量耗竭，損害DNA，抑制DNA合成，誘導細胞調(diào)亡。NO可與氧自由基協(xié)同作用，導致細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸細胞毒性作用和酸中毒等一系列變化，導致神經(jīng)細胞損傷。

本實驗顯示，模型組大鼠腦缺血-再灌注后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙、腦梗死范圍大，MDA、NO含量增加，SOD活性降低。西紅花酸治療組與模型組比較，神經(jīng)功能明顯改善、腦梗死范圍明顯減小，MDA、NO含量降低，SOD活性增加。表明西紅花酸對腦缺血-再灌注損傷有保護作用，其作用機制可能與提高腦內(nèi)SOD的活性和降低腦內(nèi)MDA、NO含量有關(guān)。

［1］ 寇鑫暉，錢之玉.西紅花酸對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中草藥，2008，39(7):1049-1053.

［2］ 彭飛城，皋聰，錢之玉.西紅花酸對小鼠低氧損傷的保護作用［J］.中國新藥雜志，2007，16(21):1772-1775.

［3］ 向敏，錢之玉，周成華.西紅花酸對糖尿病大鼠體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物的形成及其受體表達的影響［J］.中國臨床藥理學與治療學，2006，11(4):448-452.

［4］ LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusin without craniect omy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［5］ 王培源，王海萍，李光武.葛根黃酮對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中國中藥雜志，2006，31(7):577-579.

［6］ 張麗娟，孔軍伶.山茱萸多糖的提取工藝優(yōu)化及對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中藥材，2007，30(11):1466-1468.