榅桲子總黃酮提取工藝研究*

哈及尼沙，地力夏提·艾比布拉，美麗萬·阿不都熱依木，阿吉艾克拜爾·艾薩

(1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049;3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830054)

榅桲(Cydonia Oblonga)是維吾爾醫(yī)常用的具有濃郁的地方民族色彩的傳統(tǒng)維藥。榅桲子有強(qiáng)化皮膚保濕力，光滑皮膚，退燒，止咳，降低干躁等作用［1-4］，在維吾爾醫(yī)中常用主治干熱性或膽液質(zhì)性疾病，如:發(fā)熱舌燥、傷寒、肺結(jié)核、咳嗽、感冒、腸瘍腹瀉等［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6-8］，榅桲子含有黃酮類及酚類成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗?jié)兒涂鼓[瘤等活性。目前筆者還未見該藥材總黃酮含量測(cè)定及提取工藝研究的報(bào)道。為了該藥材的進(jìn)一步研究，在參考《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)中總黃酮測(cè)定方法的基礎(chǔ)上［9］，采用乙醇提取，紫外可見分光光度法首次測(cè)定維藥榅桲子中總黃酮含量，得到最佳提取工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(北京賽多利天平有限公司)，UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，XMT-DA型電子恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥 蘆丁化學(xué)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080-200707，純度:92.5%)，亞硝酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，氫氧化鈉(天津市紅巖化學(xué)試劑廠)，硝酸鋁(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，無水乙醇(天津市紅巖化學(xué)試劑廠)等試劑均為分析純。

榅桲于2009年10月采自新疆克拉瑪依州上阿圖什鄉(xiāng)，榅桲子從該新鮮成熟榅桲果實(shí)中分離、室溫下干燥。將干燥種子粉碎，過篩孔內(nèi)徑(180.0±7.6)μm(80目)篩，得榅桲子粉末。并由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所蘇萊曼主任藥師鑒定為榅桲子。

2 方法與結(jié)果

2.1 榅桲子總黃酮的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，加75%乙醇超聲完全溶解，定容至100 mL量瓶中，搖勻，制成濃度為0.250 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 和7.0 mL置于25 mL量瓶中，各加5%亞硝酸鈉0.5 mL，放置6 min后，加8%硝酸鋁0.5 mL，放置6 min，再加1 mol·L-1氫氧化鈉 5 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加標(biāo)準(zhǔn)品的溶液作空白，取中等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在400～800 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，在506.5 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁質(zhì)量濃度和吸光度的關(guān)系為:Y=7.754 5X+0.066 3，r=0.999 7。在吸光度＜0.5的范圍內(nèi)，吸光度和濃度保持較好的線性關(guān)系。

2.1.2 榅桲子總黃酮含量的測(cè)定 稱取一定量榅桲子粉末，用適量75%乙醇回流2 h，抽濾后濾液置于50 mL量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，搖勻。取此樣品液5.0 mL置于25 mL量瓶中，然后按“2.1.1”方法測(cè)定提取液的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品總黃酮的含量?？傸S酮含量=榅桲子中總黃酮提取量/榅桲子質(zhì)量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)及水平考察 將原料榅桲子粉末按1∶10～1∶35(倍)的料液比加入濃度為55% ～95%乙醇溶液，然后在溫度30～70℃條件下提取0.5～3 h，1～4次，每次改變其中1個(gè)因素，分析該因素對(duì)提取量的影響。用單因素實(shí)驗(yàn)來確定總黃酮最佳提取條件。

由于各因素之間有相互交叉影響，因此要全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以總黃酮提取量作為主要考察指標(biāo)。

2.3 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度對(duì)提取量的影響 精密稱取榅桲子5份，每份5.00 g，分別取體積分?jǐn)?shù)為55%，65%，75%，85%和95%乙醇溶液各100 mL，在60℃水浴中回流提取2 h，趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”方法計(jì)算黃酮含量，結(jié)果黃酮含量分別為 4.00，10.25，10.50，7.75 和5.75 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著乙醇濃度的增加，總黃酮含量降低。低濃度乙醇中水分含量較多，可促進(jìn)植物在水中的膨脹，提高植物和溶劑的接觸面。從實(shí)驗(yàn)中也可以看出:乙醇濃度為75%時(shí)黃酮含量最高，所以75%乙醇選為最佳乙醇提取濃度。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末6份，每份5.00 g，在料液比為1∶20的提條件下，加75%乙醇溶液，在60℃水浴中分別回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 和 3.0 h，趁熱過濾，冷卻后按照“2.1.2”的方法計(jì)算黃酮含量，結(jié)果黃酮含量分別為6.75，8.00，8.25，9.50，9.75 和8.25 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，提取效果最好。而當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，總黃酮含量反而降低。這可能是由于提取時(shí)間太長(zhǎng)，部分乙醇被揮發(fā)而導(dǎo)致溶液沸點(diǎn)逐漸增大，從而破壞某些黃酮類化合物。

2.3.3 料液比對(duì)提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末6份，每份5.00 g，分別加75%乙醇溶液，料液比(倍)分別為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 和1∶35，在75℃水浴中回流提取2 h，趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”的方法計(jì)算黃酮含量，結(jié)果黃酮含量分別為 6.25，9.50，5.25，6.50，6.75 和 7.00 mg·g-1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:料液比1∶15(倍)時(shí)總黃酮提取量最高，因此選擇料液比1∶15(倍)為最佳提取料液比。

2.3.4 提取溫度對(duì)提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末7份，每份5.00 g，乙醇濃度為75%，料液比為1∶15，分別在30，40，50，60，70，80 和 90 ℃恒溫水浴中回流2 h。趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”方法進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定。結(jié)果黃酮含量分別為2.25，3.75，5.75，8.25，9.00，5.55 和 7.25 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:70℃時(shí)總黃酮含量最大，黃酮在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，但溫度＞70℃時(shí)發(fā)現(xiàn)含量走勢(shì)不穩(wěn)定。溫度太高有可能破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，可能溶劑揮發(fā)率增加而影響黃酮的提取量，所以初步選70℃為最佳提取溫度，進(jìn)一步用正交實(shí)驗(yàn)來確定最終提取溫度。

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響 精密稱取榅桲子藥材粉末4份，每份5.00 g，以75%乙醇溶液為提取溶劑、料液比為1∶30下，分別在70℃恒溫水浴中回流1，2，3和4次，每次2 h。趁熱過濾，冷卻后按照“2.1.2”的方法進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果黃酮含量分別為1.50，5.75，6.50和6.50mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:提取2次以上時(shí)總黃酮提取率明顯增高，提取3次時(shí)總黃酮含量最高與提取4次的總黃酮含量差別不大，為了節(jié)約提取時(shí)間選擇提取3次為最佳的提取次數(shù)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 榅桲子總黃酮的提取量受到很多因素的影響，根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、乙醇濃度(D)對(duì)榅桲子總黃酮的提取量均有影響。由于各因素之間有相互交叉影響，要全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)。通過以上單因素實(shí)驗(yàn)，找出最佳單因素，在最佳單因素?cái)?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以總黃酮提取量作為主要考察指標(biāo)。因素和水平見表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Tab．2 Results of L9(34)orthogonal test

表3 4因素方差分析Tab．3 Variance analysis of 4 factors

從表2中的 K1，K2，K3，R 分析得到:乙醇濃度，提取時(shí)間，料液比，提取溫度4種因素對(duì)榅桲子總黃酮提取的影響程度依次為:乙醇濃度 (D)＞料液比(C)＞提取時(shí)間(B)＞提取溫度(A)。比較各因素的極差R可知，料液比和乙醇濃度的極差較大，說明它們對(duì)總黃酮的提取量影響較為顯著;而提取時(shí)間和提取溫度的極差較小，說明對(duì)總黃酮提取量的影響較小。總黃酮的提取量隨乙醇濃度先升高，而后有所下降，在75%時(shí)提取量最高，濃度＞75%時(shí)提取量下降，可能是由于乙醇濃度過大時(shí)，在加熱條件下，溶劑揮發(fā)從而較多損失的緣故。

由表3可知，料液比和乙醇濃度在置信度95%水平上對(duì)提取量影響顯著。通過以上綜合分析，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和極差分析，確定最佳提取工藝為A2B3C1D2，即提取溫度為60℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶10，乙醇濃度75%，提取3次。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳工藝:提取溫度為60℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶10，乙醇濃度75%的條件下，重復(fù)3次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的平均提取量為13.60 mg·g-1。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之間相差很小，說明該工藝穩(wěn)定可靠，可作為有機(jī)溶劑提取榅桲子的最佳工藝。

3 討論

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，確定榅桲種子中總黃酮的提取條件為:乙醇濃度75%，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶15，提取溫度70℃，提取次數(shù)3次。各因素之間有相互交叉影響，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，影響總黃酮提取量的因素主次順序?yàn)?乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。確定提取條件為75%乙醇作溶劑，料液比1∶10，溫度為60℃，提取3次，每次提取時(shí)間2.5 h，得到榅桲子中黃酮類物質(zhì)總含量為13.60 mg·g-1。根據(jù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該提取工藝穩(wěn)定性好，可靠。

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，測(cè)定榅桲子中總黃酮含量，選擇最佳提取工藝條件。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低，提取效果好，可用于檢測(cè)榅桲子中黃酮含量，為該藥材的進(jìn)一步系統(tǒng)研究提供了依據(jù)。

(志謝:感謝“中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家外國(guó)專家局創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)國(guó)際合作伙伴計(jì)劃”項(xiàng)目和國(guó)家杰出青年基金項(xiàng)目的資助)

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