HPLC-MS/MS測定大鼠血漿中丹參素鈉的濃度

王 晶，金 磊，熊禮燕，王庭芳, 2，鄭莉萍, 2，張 寧，鄒 豪，張 川

(1．第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433；2．福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350108；3．上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

HPLC-MS/MS測定大鼠血漿中丹參素鈉的濃度

王 晶1，金 磊1，熊禮燕1，王庭芳1, 2，鄭莉萍1, 2，張 寧3，鄒 豪1，張 川1

(1．第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433；2．福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350108；3．上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

目的建立液質聯(lián)用色譜法(HPLC-MS/MS)測定SD大鼠血漿中丹參素鈉的濃度。方法血漿樣品采用液液萃取方法進行預處理。色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)；流速為1.0 ml/min；質譜條件：采用ESI離子源，負離子檢測，選擇MRM測定丹參素鈉和酮洛芬197→135 m/z和253→209 m/z。結果丹參素鈉在10.6 ～1 060 ng/ml檢測濃度范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 6)，最低定量限為10.6 ng/ml，日內和日間精密度的RSD<7.8 %，回收率在99 %到102 %之間。結論該方法靈敏度高、快速、簡單、準確，適用于血漿樣品中丹參素鈉的含量測定以及臨床前實驗研究。

丹參素鈉；HPLC-MS/MS；血藥濃度

丹參來源于唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。丹參有擴張冠狀動脈，防止心肌缺血[1]，促進血液循環(huán)[2]，降血脂，消炎抗菌作用[3]。丹參主要分為脂溶性和水溶性成分[4]。水溶性成分中丹參素的含量較高，活性較強，作為丹參的質量控制指標成分。

丹參素[D(+)-β-(3，4-二羥基苯基)-乳酸]具有抗炎、抗氧化[5]、抗血栓、抗心肌缺血、抗腫瘤[6]等作用，并且能清除自由基和抗氧化[7]，抑制血小板聚集[8]，改善微循環(huán)，調節(jié)血脂代謝等作用[9]。常用的檢測方法有LC-UV[10～12], LC-FLD[13], LC-DAD[14]。本文采用HPLC-MS/MS方法建立了SD大鼠血漿樣品中丹參素鈉的含量測定方法。

1 材料與儀器

1.1藥品和試劑 丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，純度99.6 %)，酮洛芬對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量95.6 %)，甲醇為美國Merck公司生產的色譜純試劑，乙酸乙酯為上海勝德化工有限公司生產，甲酸為FEDIA公司，濃鹽酸為國藥集團化工有限公司生產，水為去離子水。

1.2儀器 VARIAN 1200L液相色譜-質譜聯(lián)用儀，包括VARIAN ProStar 210高壓泵，VARIAN ProStar 410自動進樣器，VARIAN 1200L Quadrupole MS/MS儀，VARIAN MS 6.8 工作站。XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)，CR3i臺式高速冷凍離心機(ThermoFisher公司)，thermofisher SPD121減壓離心濃縮(ThermoFisher公司)，HA-202M電子天平(A&D Company LTD)。

2 方法與結果

2.1實驗條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18，(200 mm×4.6 mm，5 μm)柱溫25 ℃ ，流動相：甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)，采用等梯度洗脫方式，流速 0.80 ml/min，3:2分流入質譜的流速為0.32 ml/min，進樣量20 μl，分析時間9.0 min。

2.1.2質譜條件 采用氣動輔助電噴霧離子化電離源(ESI)，負離子方式檢測；噴霧電壓(SP)4700V；加熱毛細管溫度(TEM)為250 ℃；碰撞氣(CID)壓力1.65 mTorr；源內碰撞誘導解離(Source CID)能量為18.0 V；質譜掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)，分別測定丹參素鈉和酮洛芬反應離子m/z 197→135和m/z 253→209；掃描時間為0.5 s。

2.2 標準溶液的制備 ①丹參素鈉標準溶液：精確稱取丹參素鈉對照品10.6 mg，用甲醇配制成濃度為1.06 mg/ml的標準溶液，-80℃保存待用，1個月后重新配制。②酮洛芬標準溶液(內標)：精確稱取一定量酮洛芬，用甲醇配制成濃度為102.4 ng/ml的內標溶液，-80 ℃保存待用，1個月后重新配制。

用丹參素鈉對照品配成一系列濃度的標準溶液，分別取各濃度標準溶液10 μl于90 μl空白血漿中，使丹參素鈉的血漿終濃度分別為10.6、21.2、53、106、212、530、1 060 ng/ml，余同血漿樣品的處理和測定。

2.3血漿樣品的前處理方法 精密量取血漿樣品100 μl，置于1.5 ml的塑料離心管中，加入50 μl內標(酮洛芬甲醇溶液，102.4 ng/ml)，渦旋30 s，再加入50 μl的鹽酸溶液(3 mol/L)，渦旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，渦旋3 min, 離心(5000 r/min )10 min分層，取上清800 μl轉移至另一1.5 ml塑料離心管中，冷凍離心機吹干，100 μl流動相復溶，渦旋1 min，離心(12 000 r/min)10 min，取上清20 μl進樣檢測。

2.4分析方法的專屬性 按上述LC-MS/MS條件測得6只SD健康大鼠的空白血漿；空白血漿+丹參素鈉標準樣品+內標；受試大鼠靜脈注射丹參素鈉后的血漿樣品質量色譜圖，見圖1。丹參素鈉與酮洛芬的保留時間分別為6.7 min和7.0 min，由圖可見血漿中內源性物質不干擾測定。

2.5線性范圍與定量限 將不同濃度系列標準樣品測得的丹參素鈉與內標峰面積比值為縱坐標，丹參素鈉濃度為橫坐標，直線加權回歸。結果表明血漿中丹參素鈉濃度在10.6～1 060 ng/ml范圍內濃度與峰面積有良好的線性關系y=0.003528x-0.031(r=0.999 6)。方法的最低定量限為10.6 ng/ml(S/N>10)，其RSD值為9.8%。

2.6精密度與回收率 按丹參素鈉標準曲線制備方法制備質控樣品，對21.2，106和 848 ng/ml 3種濃度進行了連續(xù)3 d的5份樣本分析，以評價方法的日內、日間精密度。同時以流動相代替空白血漿，同樣方法配制高、中、低3種濃度(21.2、106、848 ng/ml )的標準樣品，計算回收率。低、中、高3個濃度的準確度分別為(21.08 ± 1.54)、(106.52 ± 4.12)、(846.04 ± 5.22) ng/ml；日內精密度分別為 7.30、3.87、0.64%；日間精密度分別為5.42、3.57、0.55%；提取回收率分別為(100.46 ± 5.44)%、(101.88 ± 3.64)%、(99.11 ± 0.54)%。

2.7分析樣品的穩(wěn)定性 將丹參素鈉標準溶液配制的(21.2、106、848 ng/ml)的血漿樣品，按上述操作進行穩(wěn)定性考察：血漿樣品室溫放置2 h的穩(wěn)定性；血漿樣品處理后放置4 h的穩(wěn)定性；室溫與-80 ℃凍融3次的穩(wěn)定性；-80 ℃保存20 d的穩(wěn)定性。每個濃度點測定5份樣品與放置0 h的樣本進行比較，計算后各濃度變異均小于15%，穩(wěn)定性符合指導原則。

3 討論

3.1血漿樣品前處理方法的選擇 實驗開始時嘗試使用蛋白沉淀法，空白血漿中出現(xiàn)干擾或雜質，而且提取回收率低，因此選擇回收率高，選擇性好的液液萃取方法，乙酸乙酯作為萃取溶劑。

3.2流動相的選擇 實驗中發(fā)現(xiàn)甲醇對丹參素鈉色譜行為影響較大，流動相中甲醇比例越高，丹參素鈉保留時間越長，柱效下降，峰形較差。實驗中還發(fā)現(xiàn)，流動相為甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)時，丹參素鈉及其內標物酮洛芬的峰形較好，響應強度最大，故選擇甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)為流動相。

4 結論

建立了測定SD大鼠體內丹參素鈉血藥質量濃度LC-MS/MS法。血漿中無干擾測定的內源性物質，線性范圍為10.6～1 060 ng/ml，定量下限為10.6 ng/ml，批內、批間精密度均小于7.8%，回收率在99%～102%之間。該方法靈敏，簡單，準確，可用于SD大鼠血漿中丹參素鈉的含量測定及其臨床前試驗研究。

[1] Ji XY, Tan BK, Zhu YZ. Salvia miltiorrhiza and ischemic diseases[J]. Acta Pharmacol Shin, 2000, 21(12): 1089.

[2] Chen KJ. Certain progress in the treatment of coronary heart disease with traditional medicinal plants in China[J]. Am J Chin Med, 1981, 9(3): 193.

[3] 呂亞青.丹參的化學成分及臨床應用進展[J]. 中國藥房, 2007, 18(12): 917.

[4] Zeng G, Xiao H, Liu J,etal. Identification of phenolic constituents in Radix Salvia miltiorrhizae by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20(3): 499.

[5] Huang YS, Zhang JT. Antioxidative effect of three watersoluble components isolated from Salvia miltiorrhiza in vitro[J]. Acta Pharm Sin, 1992, 27(2): 96.

[6] Zhang LJ, Chen L, Lu Y,etal. Danshensu has anti-tumor activity in B16F10 melanoma by inhibiting angiogenesis and tumor cell invasion[J]. Int J Pharm, 2010, 643(2-3): 195.

[7] Zhao GR, Zhang HM, Ye TX,etal. Characterization of the radical scavenging and antioxidant activities of danshensu and salvianolic acid B[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(1): 73.

[8] 金昔陸, 陳濱凌, 吳衛(wèi)江,等. 8 種丹參素衍生物對兔血小板聚集性的影響[J]. 上海醫(yī)科大學學報, 2000, 27(3): 181.

[9] 趙新峰, 祝忠民, 劉愛芳, 等. 柱切換法在復方丹參滴丸中丹參素藥代動力學研究中的應用[J]. 中成藥, 2004, 26(6): 490．

[10] Li XL, Li XR, Wang LJ,etal. Simultaneous determination of danshensu, ferulic acid, cryptotanshinone and tanshinone IIA in rabbit plasma by HPLC and their pharmacokinetic application in danxiongfang[J]. J Pharmaceut Biomed, 2007, 44(5): 1106.

[11] 智紅英, 鐘大放, 馬小菊, 等. 高效液相色譜法測定犬血漿中丹參素鈉[J]. 中草藥, 2009, 40(6): 886.

[12] 蔣亞萍, 胡小鷹. 丹七注射液中丹參素鈉在Beagle犬體內藥代動力學及生物利用度研究[J]. 安徽醫(yī)藥, 2009, 13(1): 17.

[13] 胡珊珊, 劉 潔, 劉文靜, 等. HPLC-FLD法測定丹參素在家兔組織中的分布[J]. 第四軍醫(yī)大學學報, 2008, 29(7): 670.

[14] 張 雪, 梅文靜, 劉文娜, 等. 高效液相色譜二極管陣列檢測法同時測定丹參滴注液中四種水溶性成分的含量[J]. 分析化學學報, 2010, 29(1): 109.

2011-03-01

[修回日期] 2011-03-07

DeterminationofsodiumDanshensuinratplasmabyHPLC-MS/MS

WANG Jing1, JIN Lei1, XIONG Li-yan1, WANG Ting-fang1, 2, ZHENG Li-ping1, 2, ZHANG Ning3, ZOU Hao1, ZHANG Chuan1

(1. New drug research center, School of Pharmcy, Second military medical university, Shanghai 200433, China; 2. School of Pharmacy, Fujian university of traditional Chinese medcine , Fuzhou 350108, China; 3. Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031, China)

ObjectiveTo estiblish a method of determining sodium Danshensu in rat plasma by HPLC-MS/MS.Methodssodium Danshensu was extrated for determination by HPLC-MS/MS. Analytical column was Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm ,5 μm). The mobile phase was methanol:water (0.01‰ formic acid )= 80:20. Mass spectrum conditions were ESI performing in the MRM mode using target ions m/z 197→135 (Sodium Danshensu), m/z 253→209 (ketoprofen).ResultsThe calibration curve was liner over the range of 10.6～1 060 ng/ml. The LLOQ of sodium Danshensu in plasma was 10.6 ng/ml. The intra-day and inter-dayRSDwere<7.8%. The extracted recovery was ranged from 99% to 102%.ConclusionThe method was sensitive, rapid, simple and accurate to sodium Danshensu plasma concertration and suitable to study preclinical test of sodium Danshensu.

sodium Danshensu; HPLC-MS/MS; plamsma concentration

王 晶(1984-)，女，碩士研究生. E-mail:laoer-wangjing@163.com.

張 川. Tel：(021)81871358， E-mail:zhangchuan@smmu.edu.cn.

R92

A

1006-0111(2011)02-0109-03