瑞香狼毒提取物尼地嗎啉的抗腫瘤研究概況

王園園，王 鑫，王義善(解放軍第107醫(yī)院國(guó)家中西醫(yī)結(jié)合腫瘤治療重點(diǎn)專科，山東煙臺(tái) 264002)

瑞香狼毒(Stellera chamaejasma L.，簡(jiǎn)稱SC)治療腫瘤在我國(guó)古代醫(yī)學(xué)典籍中早有記載，《本經(jīng)》中就有:“狼毒破積聚，治惡瘡，消蠱毒”的論述，又有逐水、祛痰、破積、殺蟲之功效。近年來國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道瑞香狼毒在抗腫瘤研究的藥理實(shí)驗(yàn)較多，是一種很有前途的抗腫瘤藥物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明對(duì)小鼠移植性腫瘤有一定的抑制作用［1］。動(dòng)物體內(nèi)實(shí) 驗(yàn)、體外腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)均證明，瑞香狼毒有明顯的抗腫瘤作用。

為進(jìn)一步探究瑞香狼毒抗腫瘤的活性成分，尋找新的抗腫瘤靶點(diǎn)，在對(duì)中藥瑞香狼毒抗腫瘤有效成分篩選中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瑞香狼毒進(jìn)行了多種分離萃取。在瑞香狼毒甲醇提取物中，得到多種二萜活性成分，其中，尼地嗎啉(gnidimacrin)顯示出了較強(qiáng)的抗腫瘤活性［2］。

1 對(duì)尼地嗎啉抗腫瘤活性的研究

河北醫(yī)科大學(xué)的馮威健與日本的Ikegawa等發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒中二萜類化合物有抗癌活性并重點(diǎn)研究了尼地嗎啉，發(fā)現(xiàn)其具有較寬的抗癌譜及較強(qiáng)的抗癌活性，是瑞香狼毒中的主要抗腫瘤活性成分［3］。

1.1 尼地嗎啉單體成分的獲得 尼地嗎啉，從西藏產(chǎn)瑞香狼毒的干燥根莖經(jīng)甲醇提取、石油醚復(fù)提、硅膠層析，最后經(jīng)反相型高壓液相分離獲得［4］。尼地嗎啉為白色粉末，屬瑞香烷型二萜類化合物，脂溶性，但在血清中仍然具有很好的物理穩(wěn)定性以及抗腫瘤活性，從Gnidia subcordata首次分離，并于1976年由 Kupchan［5］首次報(bào)道。

1.2 尼地嗎啉具有較強(qiáng)的抗癌活性 馮威健和日本學(xué)者應(yīng)用MTT法和克隆形成法，觀察了尼地嗎啉對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562和胃癌Kato-III、MKN-28、MKN-45 及小鼠 L-1210 的細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成抑制作用，其IC50在0.007～0.000 12 μg/ml，范圍以 0.02 ～0.03 mg/kg腹腔注射，可使小鼠白血病P-388和L-1210腹水型的生命延長(zhǎng)70% 和80%。以0.01～0.02 mg/kg腹腔注射，可使小鼠實(shí)體瘤Lewis肺癌、黑色素瘤B-16和結(jié)腸癌26的生命延長(zhǎng)40%、49%和41%。SC的甲醇提取物以10 mg/kg劑量ip時(shí)的生命延長(zhǎng)率是79%，進(jìn)一步用石油醚復(fù)提后，以1mg/kg ip時(shí)的生命延長(zhǎng)率為57%。

有對(duì)瑞香狼毒甲醇提取物的研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后洗去或不洗去瑞香狼毒甲醇提物對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用無明顯不同，說明甲醇提物的這種作用在24 h時(shí)即已發(fā)揮，且一旦發(fā)揮即可自行維持至少9 d。推測(cè)，尼地嗎啉抗腫瘤效應(yīng)發(fā)揮可能也在進(jìn)入體內(nèi)后24 h內(nèi)，且可以長(zhǎng)時(shí)間維持藥效［6］。

1.3 尼地嗎啉抗癌細(xì)胞毒作用以抑制癌細(xì)胞增殖形成克隆為主 尼地嗎啉對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠白血病L-1210具有很強(qiáng)的抑制作用，結(jié)果顯示，對(duì)用MTT法測(cè)定的培養(yǎng)4 d的癌細(xì)胞的增殖抑制在0.1～0.000 1 μg/ml濃度范圍;對(duì)用克隆形成試驗(yàn)測(cè)定的培養(yǎng)7 d癌細(xì)胞的克隆形成抑制在0.01～0.000 01 μg/ml濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)為直線性濃度依賴性抑制作用，并且對(duì)克隆形成的抑制作用較對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為明顯。實(shí)驗(yàn)表明，尼地嗎啉是通過抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制癌細(xì)胞增殖形成克隆而發(fā)揮抗癌作用的，即細(xì)胞毒作用，并且以抑制癌細(xì)胞增殖形成克隆為主［4］。

1.4 尼地嗎啉體外抗癌活性高于長(zhǎng)春新堿和阿霉素 尼地嗎啉對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠白血病L-1210的50% 抑制濃度在MTT法和克隆形成試驗(yàn)中分別是0.001 μg/ml和 0.000 2μg/ml，而長(zhǎng)春新堿的 50%抑制濃度分別是 0.005 μg/ml和 0.001 μg/ml。在兩種試驗(yàn)方法中，尼地嗎啉的50%抑制濃度均較長(zhǎng)春新堿低。

尼地嗎啉對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562的IC50在MTT法和克隆形成試驗(yàn)分別是0.000 45 μg/ml和 0.000 6 μg/ml，對(duì)人胃癌 Kato-3 的 IC50在 MTT法和克隆形成試驗(yàn)分別是 0.000 75μg/ml和0.002μg/ml。阿霉素對(duì)人白血病 K562的 IC50在MTT法和克隆形成試驗(yàn)分別是 0.047 μg/ml和0.055μg/ml，對(duì)人胃癌Kato-3的 IC50在 MTT法和克隆形成試驗(yàn)分別是0.044 μg/ml和 0.05 μg/ml。尼地嗎啉對(duì)人癌培養(yǎng)細(xì)胞株K562和Kato-3的IC50，無論是MTT法還是克隆形成法均低于阿霉素。

1.5 尼地嗎啉抗癌活性與腫瘤細(xì)胞的物種有關(guān) 馮威健等［4］的研究資料表明，瑞香狼毒甲醇提取物對(duì)小鼠L-1210和P388等血液系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞系的抗瘤效果好;王潤(rùn)田［6］也發(fā)現(xiàn)人來源的白血病腫瘤細(xì)胞系K562對(duì)醇提物的敏感性遠(yuǎn)高于小鼠來源的腫瘤細(xì)胞系S180和YAC-1。以上資料提示，尼地嗎啉的抗腫瘤作用可能與腫瘤細(xì)胞的物種來源有關(guān)，有可能人源性腫瘤細(xì)胞和血液來源的腫瘤細(xì)胞對(duì)瑞香狼毒甲醇提取物或尼地嗎啉更為敏感。

2 尼地嗎啉抗癌機(jī)制研究

2.1 細(xì)胞毒作用 對(duì)尼地嗎啉抗癌的相關(guān)研究從形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尼地嗎啉作用后的細(xì)胞膜有明顯的突起樣改變，有絲分裂明顯減少，細(xì)胞呈現(xiàn)多核化、巨核化改變，以及胞體變大、染色質(zhì)減少等改變，說明細(xì)胞毒作用可能是尼地嗎啉抗腫瘤的主要機(jī)制［7，8］。2003 年，王潤(rùn)田對(duì)瑞香狼毒甲醇提取物抗瘤機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究表明，醇提物作用24 h的K562分裂期細(xì)胞減少，p53、bcl-2和c-myc的表達(dá)都有所增加，但凋亡基因p53表達(dá)增加顯著，因此凋亡細(xì)胞增加。醇提物繼續(xù)作用至48 h，分裂期細(xì)胞進(jìn)一步減少，而G0/G1細(xì)胞明顯增加，p53表達(dá)達(dá)最高值，bcl-2表達(dá)明顯減低，因此細(xì)胞凋亡率增加，電鏡可見凋亡形態(tài)學(xué)改變。醇提物作用72 h，分裂期細(xì)胞更少，G0/G1期細(xì)胞繼續(xù)增加;p53表達(dá)雖有下降，但仍高于對(duì)照，而bcl-2和c-myc表達(dá)均明顯降低，發(fā)生凋亡的細(xì)胞更多，電鏡觀察易見典型的凋亡形態(tài)改變。以上研究結(jié)果提示，醇提物抗瘤機(jī)制可能與其能阻滯腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。由此，可以預(yù)測(cè)尼地嗎啉抗癌機(jī)制可能也與其能阻滯腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

對(duì)尼地嗎啉抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)是一個(gè)比較強(qiáng)的蛋白激酶C的一個(gè)激活劑［9，10］。應(yīng)用敏感的人類白血病 K562細(xì)胞和難以控制的鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HLE細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)尼地嗎啉對(duì)前者的作用是后者的3倍。斑點(diǎn)免疫法分析證明，K562細(xì)胞出現(xiàn)蛋白激酶Cβ2表達(dá)增加，而HLE細(xì)胞蛋白激酶Cα表達(dá)增加。在尼地嗎啉以0.000 5mg/ml與K562細(xì)胞作用24 h后，出現(xiàn)G1期阻滯和CDK2活性受抑制;濃度為0.005 mg/ml時(shí)，G1期阻滯最大，且 CDK2活性受完全抑制;濃度為0.05 mg/ml時(shí)，其生物效應(yīng)降低。在24 h之后，K562細(xì)胞的蛋白激酶C的量和生物學(xué)效應(yīng)均沒有改變，但出現(xiàn)低于對(duì)照組1/10的下調(diào)控，生物學(xué)效應(yīng)的降低可能是蛋白激酶C結(jié)果。

2.2 免疫調(diào)節(jié)作用 王潤(rùn)田［6］研究了瑞香狼毒甲醇提取物對(duì)正常脾細(xì)胞生長(zhǎng)、對(duì)CoA刺激正常脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化及對(duì)正常脾細(xì)胞NK活性的影響。結(jié)果顯示，醇提物與正常脾細(xì)胞共育24 h時(shí)，0.001、0.01 μg/ml醇提物組的生長(zhǎng)指數(shù)與對(duì)照無差異，而0.1～10 μg/ml醇提物可刺激脾細(xì)胞增殖(P ＜0.05)，并呈劑量依賴式;共育至48、72 h，0.001 ～10 μg/ml醇提物對(duì)脾細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照無差異(P＞0.05)。0.001、0.01 μg/ml醇提物對(duì) ConA 刺激的正常脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化無影響;0.1～10 μg/ml醇提物與最適量和亞適量 ConA 同刺激作用。0.1 μg/ml和 1 μg/ml醇提物作用的脾細(xì)胞 NK活性分別為(35.16±1.73)%、(36.53±2.14)%，與對(duì)照組(18.53±1.98)%差異有顯著性(P＜0.05);而同時(shí)間內(nèi)醇提物本身對(duì)YAC-1活性無明顯影響。王潤(rùn)田提出瑞香狼毒醇提物抗癌機(jī)制可能與其可刺激脾細(xì)胞增殖，協(xié)同ConA刺激脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化和提高脾細(xì)胞NK殺傷活性有關(guān)。

2.3 協(xié)同誘導(dǎo)作用 賈正平等［11］研究了瑞香狼毒小鼠藥物血清增敏化療藥物對(duì)K562/VCR耐藥細(xì)胞的抗癌活性，結(jié)果表明，瑞香狼毒小鼠藥物血清可明顯增強(qiáng)長(zhǎng)春新堿、阿霉素和足葉乙苷體外抗肝癌細(xì)胞活性，并可協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，降低BCL-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，減少DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于G2/M期，從而起到抗腫瘤作用。

馬健等［12］以人肝癌耐藥Bel5-FU2000細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用小鼠血清藥理學(xué)方法，細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)及MTT比色法研究瑞香狼毒提取物誘導(dǎo)耐藥肝癌細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果表明，瑞香狼毒具有協(xié)同抗腫瘤藥物誘導(dǎo)耐藥肝癌細(xì)胞凋亡的作用，其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用與其協(xié)同抗腫瘤藥物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。

樊俊杰等［13～16］總結(jié)瑞香狼毒抗腫瘤可能的主要機(jī)制包括協(xié)同誘導(dǎo)作用。瑞香狼毒小鼠藥物血清可明顯增強(qiáng)DOX和VP-16體外抗肝癌細(xì)胞活性，并可協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，降低BCL-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于G2/M期。

綜上所述，尼地嗎啉抗腫瘤作用可能是藥物直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、對(duì)免疫功能的增強(qiáng)作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用的綜合效應(yīng)。

3 尼地嗎啉臨床應(yīng)用中存在的問題

3.1 活性劑量接近于毒性劑量 瑞香狼毒有很強(qiáng)的刺激性，可引起皮膚和黏膜炎癥、充血、水腫、起泡等;過量服用可致中毒，而出現(xiàn)口干麻木、頭昏、肢體軟弱無力、疲倦欲睡、惡心、嘔吐、腹部不適，甚至腹痛、腹瀉(出血性便)而休克。瑞香狼毒中的主要有效成分尼地嗎啉亦有較大毒性，ip劑量超過0.105 mg/kg 時(shí)即出現(xiàn)毒性反應(yīng)［17，18］。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射的活性劑量(0.102 mg/kg)與毒性劑量(0.105 mg/kg)較接近。孫麗君認(rèn)為尼地嗎啉抗腫瘤的有效劑量范圍較窄，大劑量則無治療作用且毒性很大［19］。

而鄔俊等［20］對(duì)瑞香狼毒急性毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒一次灌服12 g/kg，相當(dāng)藥材48 g/kg，LD50無法測(cè)出。用最大耐受量方法測(cè)定1日2次給藥，計(jì)算出最大耐受量相當(dāng)臨床240倍(按50 kg體重計(jì)算)，最大服藥量為24 g/kg，相當(dāng)藥材96 g/kg。鄔俊認(rèn)為瑞香狼毒毒性作用可能來自藥材地上部位，狼毒地下根莖為藥材，瑞香狼毒無明顯急性毒性，臨床使用比較安全，應(yīng)修正蒙醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)瑞香狼毒大毒的觀察，以促進(jìn)瑞香狼毒在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域中的更多應(yīng)用。

3.2 生物活性部位改造難度大 潘國(guó)鳳等［21］驗(yàn)證從尼地嗎啉化學(xué)結(jié)構(gòu)分析其生物活性部位改造的難度相當(dāng)大，故權(quán)衡其藥效與毒性作用，即對(duì)受試系統(tǒng)的收益與風(fēng)險(xiǎn)等因素考慮，認(rèn)為其進(jìn)一步研究的必要性作為先導(dǎo)化合物開發(fā)空間是不大的。

由此推測(cè)，瑞香狼毒所含抗腫瘤生物活性的成分與毒性成分以及兩者之間關(guān)系復(fù)雜。潘國(guó)鳳等以中藥有效組分與整體受試系統(tǒng)相互作用作為先導(dǎo)研究范例，闡述了在病癥結(jié)合、方證對(duì)應(yīng)的中醫(yī)理論指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的理念與實(shí)施方案，認(rèn)為可以考慮將中藥藥效組分作為作用整體，以中醫(yī)系統(tǒng)生物學(xué)觀點(diǎn)去開發(fā)瑞香狼毒的藥用價(jià)值，可能是一條捷徑［22］。

臨床和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了瑞香狼毒及其成分的抗腫瘤療效，特別是尼地嗎啉，因其抗瘤譜廣、作用強(qiáng)而引起眾多學(xué)者的關(guān)注。但是，將瑞香狼毒中抗癌有效成分尼地嗎啉開發(fā)為一種抗腫瘤藥物，還需在其抗腫瘤作用機(jī)制、毒性實(shí)驗(yàn)研究以及優(yōu)化分離提取以最大程度減輕其毒性等方面進(jìn)一步深入研究。

4 總結(jié)與展望

在腫瘤的治療上，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用放療化療等聯(lián)合療法，隨著祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中西醫(yī)結(jié)合治療疾病已經(jīng)逐漸被人接受并廣泛應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展使尼地嗎啉抗腫瘤作用機(jī)制在分子生物學(xué)水平更進(jìn)一步闡明成為可能。

今后的研究方向應(yīng)該主要圍繞以下幾個(gè)方面:①利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)如基因芯片等進(jìn)一步確定尼地嗎啉抗腫瘤的主要作用機(jī)制，尤其對(duì)其影響腫瘤細(xì)胞周期與信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵環(huán)節(jié)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理應(yīng)從分子水平上進(jìn)一步探討;②從新的抗腫瘤作用機(jī)制找到突破口，如尼地嗎啉是否影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，對(duì)腫瘤血管的生成有無影響;③改進(jìn)分離提取技術(shù)或通過生物技術(shù)改造尼地嗎啉化學(xué)結(jié)構(gòu)，在確保藥效的同時(shí)，尋找科學(xué)有效的減毒脫毒方法是對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)關(guān)鍵。相信，隨著我們對(duì)瑞香狼毒抗癌有效成分尼地嗎啉的深入細(xì)致的分析研究，西醫(yī)治療方法結(jié)合使用中藥制劑尼地嗎啉將會(huì)為腫瘤的治愈提供新的希望。

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