CC10蛋白功能及在疾病中的作用研究進(jìn)展

魏穎，徐玉東，尹磊淼，單純筱，冉君，王宇，劉曉燕，楊永清

Clara 細(xì)胞是一種分布于哺乳動(dòng)物肺臟末端細(xì)支氣管的非纖毛、非漿液分泌上皮細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能。在氣管支氣管樹(shù)分叉處的Clara 細(xì)胞是支氣管上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，有助于損傷后上皮再生[1-2]。Clara 細(xì)胞 10-kD蛋白（clara cell 10-kD protein，CC10）是Clara 細(xì)胞分泌的一種分子量為10-kD的分泌蛋白。其通過(guò)抑制磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）活性發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性[3-4]。CC10 最初因出現(xiàn)在兔生殖管道著床期，被稱(chēng)為子宮球蛋白（uteroglobin，blastokinin）。除此之外，CC10還有多種別名，如 CCSP（Clara cell secretory protein）、CC16（Clara cell 16-kD protein）、UP-1（urine protein 1）、CCPBP（Clara cell phospholipid-binding protein）、SCGB1A1（Secretoglobin family 1A member 1）等。

1 生物學(xué)特性

CC10 由兩個(gè) 70～77個(gè)氨基酸多肽反向平行構(gòu)成的二聚體形成。其分子量由氨基酸序列決定，在SDS 聚丙烯酰胺凝膠中具有高遷移率，分子量為10～12 kD。因此在最初的描述中，該蛋白被稱(chēng)為CC10蛋白。CC10 單體包含4個(gè) α 螺旋和一個(gè) β 折疊，β 折疊將 4個(gè) α 螺旋隔開(kāi)。CC10 二聚體的8個(gè) α 螺旋共同構(gòu)成一個(gè)疏水口袋，位于疏水口袋內(nèi)部的氨基酸殘基高度保守。純化人CC10蛋白 X 射線(xiàn)結(jié)晶衍射顯示類(lèi)脂占據(jù)疏水腔內(nèi)部。氣相色譜法分析該蛋白疏水腔內(nèi)類(lèi)脂抽提物顯示該蛋白對(duì)磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）的結(jié)合量幾乎相等[5]。CC10結(jié)合 PC和PI 活性可能與表面活性脂質(zhì)和肺部其他疏水分子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。CC10 通過(guò)結(jié)合 PC和PI 抑制 PLA2 活性，發(fā)揮抗炎功能[6]。

人 CC10 基因位于染色體 11q12.2-13.1 區(qū)域，該區(qū)域也編碼其他具有抗炎活性蛋白的基因[7]。CC10能夠結(jié)合鈣離子，其某些功能可能由該蛋白鈣離子螯合活性介導(dǎo)。CC10鈣離子結(jié)合位點(diǎn)形成鈣離子配體的原子空間結(jié)構(gòu)與分泌性PLA2的主要鈣離子結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)相似[8]。

2 組織細(xì)胞分布

人 CC10蛋白存在于支氣管樹(shù)非纖毛、非漿液、非黏膜柱狀細(xì)胞的分泌顆粒中。該蛋白出現(xiàn)于人類(lèi)肺臟的形成過(guò)程中，可通過(guò)免疫組化驗(yàn)查在妊娠期 21周或者羊水中出現(xiàn)[9]。CC10 主要產(chǎn)生部位在呼吸系統(tǒng)黏膜，提示其主要參與呼吸道炎癥調(diào)節(jié)。CC10 在恒河猴氣道的分布研究顯示，其遍布于氣道上皮非纖毛細(xì)胞，上氣道和中氣道表達(dá)量最多，末梢氣道較少，末端細(xì)支氣管幾乎不表達(dá) CC10[10]。CC10 也表達(dá)于胸腺、垂體腺、胃腸道、胰腺、前列腺以及精囊[11]。Cecchini等[12]研究了 CC10 在唾液腺的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn) CC10 在舌下腺管道部分表達(dá)，在腮腺和頜下腺?zèng)]有表達(dá)。

3 臨床應(yīng)用

3.1 對(duì)腫瘤細(xì)胞作用

人肺部腫瘤測(cè)定表明 10%～30% 肺部腺癌顯示出病灶局部 CC10 染色，且惡性腫瘤細(xì)胞染色較正常 Clara 細(xì)胞染色淺[13]。倉(cāng)鼠腫瘤模型顯示 CC10 染色僅在腫瘤早期出現(xiàn)，這些腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步分化為不表達(dá) CC10的鱗狀細(xì)胞癌[14-15]。B16F10 黑素瘤細(xì)胞尾靜脈注射 CC10 基因敲除大鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型同窩出生仔鼠相比，肺部腫瘤集落明顯增多。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) CC10 基因敲除大鼠肺臟過(guò)表達(dá)兩種鈣結(jié)合蛋白 S100A8和S100A9，B16F10 表達(dá)晚期糖基化終產(chǎn)物受體（advanced glycosylation end product-specific receptor，RAGE），S100A8和S100A9 既是表達(dá) RAGE的B16F10 細(xì)胞的趨化劑，也作為配體與該受體結(jié)合。用RAGE 抗體預(yù)處理 B16F10 細(xì)胞能夠抑制腫瘤遷移和侵潤(rùn)。研究還發(fā)現(xiàn) CC10 基因敲除大鼠肺臟 S100A8/S100A9濃度最高，尾靜脈濃度最低，提示 B16F10 細(xì)胞遷移至肺臟，表明 CC10 抗炎蛋白缺乏可引起肺臟黑素瘤細(xì)胞集落增加[16]。此外，與正常上皮細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞 CC10降低，表明該蛋白具有抗腫瘤增長(zhǎng)活性。體外研究顯示，CC10能夠抑制腫瘤細(xì)胞穿透基質(zhì)，提示其可能成為惡性腫瘤抑制劑[17-18]。Harvilchuck和Carlson[19]研究顯示苯乙烯及其代謝產(chǎn)物（R-styrene oxide，R-SO）能夠顯著降低 CC10水平。Clara 細(xì)胞是苯乙烯肺毒性的主要靶標(biāo)，認(rèn)為逐漸降低的CC10 水平可能引起 Clara 細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，提示CC10 可能是肺部腫瘤的早期指示劑。

3.2 對(duì)炎癥作用

動(dòng)物模型研究表明 CC10 對(duì)炎癥和纖維變性肺疾病具有保護(hù)作用[20-21]，人肺部 CC10 表達(dá)降低與肺部炎癥相關(guān)[14]。對(duì)大鼠研究表明細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘發(fā)的急性肺部炎癥中 CC10 合成與分泌顯著降低，CC10基因缺失與肺部病毒感染易感性增強(qiáng)和氧化應(yīng)激相關(guān)[22-23]。對(duì)具有急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）危險(xiǎn)因素受試者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）研究表明 CC10 濃度與彈性蛋白酶量呈逆相關(guān)，CC10蛋白濃度降低與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷相關(guān)，提示 CC10 可能是天然中性粒細(xì)胞抑制劑[24]，CC10 濃度降低可能有助于外周呼吸道炎性發(fā)生，在導(dǎo)致氣道重塑和不可逆性氣道阻塞的一系列事件中起作用。

研究顯示 CC10能保護(hù)呼吸道免受氧化應(yīng)激和炎癥損害[25]。吸煙者和慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者 BALF 中 CC10表達(dá)顯著下調(diào)，重度 COPD 患者 CC10 水平較中度患者明顯降低，表明在COPD 不同階段，CC10 表達(dá)差異顯著[26]。

CC10 具有抗細(xì)胞因子活性，其可抑制 IFN-γ、 IL-1和TNF-α 產(chǎn)生。CC10顯示出對(duì) IFN-γ 引起的抗病毒活性以及吞噬增強(qiáng)活性的抑制作用，CC10 抑制白細(xì)胞趨化活性[27]。研究顯示肺部上皮穿透性完整時(shí)，血漿 CC10 水平與BALF一致[28]，嬰兒血漿 CC10 水平增高可能與呼吸道感染引起上皮損傷有關(guān)。CC10 與中性粒細(xì)胞相互關(guān)系研究顯示，具有肺部炎癥的馬支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞含有豐富的CC10，且免疫電子顯微鏡定位顯示主要存在于胞質(zhì)和細(xì)胞核中。CC10 與馬血中性粒細(xì)胞孵育顯著降低中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)活性，增加其吞噬作用，提示該蛋白能夠進(jìn)入馬肺部炎癥中性粒細(xì)胞并改變其功能[29]。研究顯示早期重組人 CC10蛋白（recombinant human CC10，rhCC10）干預(yù)能夠增強(qiáng)表面活性劑療法對(duì)呼吸窘迫綜合征氣體交換和肺穩(wěn)定性的改善作用[30]。

3.3 對(duì)過(guò)敏性疾病作用

SELDI-TOF-MS 質(zhì)譜技術(shù)分析小鼠哮喘模型肺組織顯示 CC10是哮喘病理生理機(jī)制潛在靶蛋白之一[31]。研究顯示人體 CC10 水平降低與哮喘相關(guān)[32]。抗原致敏大鼠體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CC10 劑量依賴(lài)的顯著抑制 Th2 細(xì)胞因子表達(dá)，但對(duì) IFN-γ 沒(méi)有抑制作用。同樣發(fā)現(xiàn)其對(duì) CD4+ Th2細(xì)胞具有相似的抑制作用，但是對(duì)初始 CD4+ T 細(xì)胞沒(méi)有抑制作用。相反，CC10能夠誘導(dǎo)初始 CD4+ T 細(xì)胞表達(dá)IFN-γ，對(duì)極化的Th2 細(xì)胞卻沒(méi)有此作用。此外，CC10 對(duì)Th2 細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用與一種重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 表達(dá)降低共存。體內(nèi)研究表明，抗原激發(fā)后CC10缺失大鼠基因重組引起 Th2 細(xì)胞因子水平顯著降低，伴隨GATA-3 表達(dá)顯著降低，伴隨肺部嗜酸性粒細(xì)胞水平降低。CC10 對(duì)于調(diào)節(jié) T 細(xì)胞反應(yīng)具有直接作用，可能通過(guò)抑制GATA-3 依賴(lài)性的Th2 細(xì)胞因子產(chǎn)生抑制 Th2 細(xì)胞的功能[33]。研究顯示與野生型大鼠相比，致敏和OVA激發(fā)后CC10 缺失大鼠 IL-4、 IL-5和IL-13 表達(dá)顯著增加[34]。此外，CC10 缺失大鼠肺部炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，將 CC10 加入大鼠 Th2 細(xì)胞株顯示出下調(diào) IL-4、IL-5和IL-13 表達(dá)的作用[33]。

研究顯示 CC10 通過(guò) PLA2發(fā)揮抗炎活性[35-36]。CC10通過(guò)抑制 PLA2和前列素 D2（prostaglandin D2，PGD2）直接發(fā)揮抗炎作用。PLA2和PGD2均參與花生四烯酸炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[37-38]。PGD2主要由存在于活化肥大細(xì)胞內(nèi)的環(huán)氧合酶（COX）產(chǎn)生，具有多種生物活性，包括血管舒張，支氣管收縮以及抑制血小板聚集[39]。王秀芳等[40]研究發(fā)現(xiàn)5 歲以下哮喘兒童血清 CC10 水平降低，具有遺傳性過(guò)敏癥高風(fēng)險(xiǎn)的哮喘患兒 CC10 水平下降更明顯，血清 IgE 水平顯著增高，認(rèn)為具有遺傳性過(guò)敏癥高風(fēng)險(xiǎn)的哮喘患兒血清CC10 水平與IgE 水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

過(guò)敏性鼻炎兒童鼻灌洗液中 CC10 水平較同年齡正常兒童低[41]。有人對(duì)骨橋蛋白在過(guò)敏性鼻炎中的作用及其與CC10的關(guān)系進(jìn)行了研究，顯示骨橋蛋白在小鼠過(guò)敏性鼻炎模型中表達(dá)上調(diào)，同時(shí) CC10 表達(dá)下調(diào)；CC10 基因敲除小鼠過(guò)敏性鼻炎模型中骨橋蛋白表達(dá)上調(diào)更為明顯。致敏和激發(fā)期間給予重組CC10蛋白顯著改善 Th2 炎癥和減少鼻黏膜骨橋蛋白表達(dá)[42]。人 CC10 基因非編碼區(qū)遺傳變異會(huì)影響血漿 CC10 水平。38A 基因序列與CC10 水平降低相關(guān)，CC10 水平偏低人群具有高哮喘易感性。CC10可能通過(guò)抗炎活性發(fā)揮抗哮喘作用[43]。除了肺部上皮細(xì)胞，CC10也表達(dá)于鼠上氣道上皮細(xì)胞。嗜酸性慢性鼻竇炎（eosinophilic chronic rhinosinusitis，ECRS）發(fā)展過(guò)程中，CC10 表達(dá)逐漸下調(diào)。ECRS 形成后，CC10 基因敲除大鼠出現(xiàn)同樣的嗜酸性 Th2 反應(yīng)加重現(xiàn)象，而重組CC10 可以抑制該現(xiàn)象。CC10 缺乏會(huì)引起更嚴(yán)重的組織重塑，而組織重塑是慢性氣道炎癥的基本特點(diǎn)之一?；蛐酒芯堪l(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶 3 樣 1（chitinase 3-like 1，CHI3L1）是 ECRS 發(fā)病機(jī)制中表達(dá)上調(diào)最明顯的基因之一，其在哮喘病人肺組織和血清中表達(dá)增高并與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)[44-45]，重組CC10可以顯著抑制 CHI3L1 表達(dá)。CC10 可能通過(guò)調(diào)節(jié) CHI3L1表達(dá)發(fā)揮對(duì)氣道炎癥的調(diào)節(jié)作用[46]。Widegren等[47]研究發(fā)現(xiàn) rhCC10 以 0.56 mg 鼻腔給藥對(duì)季節(jié)性過(guò)敏性鼻炎沒(méi)有抗過(guò)敏效應(yīng)。Liu等[48]研究發(fā)現(xiàn)慢性鼻竇炎患者鼻竇黏膜CC10 水平顯著降低，同時(shí)伴隨鼻息肉和哮喘的慢性鼻竇炎患者 CC10 水平降低更明顯。CC10 水平與鼻息肉術(shù)前 CT分值以及術(shù)后內(nèi)窺鏡檢查和癥狀分值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。TNF-α、IL-1β和IL-4 抑制鼻黏膜 CC10 產(chǎn)生，INF-γ和IL-10 促進(jìn) CC10 產(chǎn)生。認(rèn)為CC10 參與慢性鼻竇炎病理生理機(jī)制，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。Zhang等[49]研究了中國(guó)漢族人群 CC10 基因變異與慢性鼻竇炎發(fā)病的關(guān)系，認(rèn)為CC10 A + 38G 單核苷酸多態(tài)性對(duì)漢族人群慢性鼻竇炎發(fā)病可能不存在實(shí)質(zhì)作用。

3.4 對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)疾病的作用

CC10 作為分泌蛋白存在于人輸卵管，盆腔炎癥性疾病和輸卵管異位妊娠患者輸卵管 CC10 表達(dá)上調(diào)，提示其參與輸卵管免疫抑制反應(yīng)[50]。

IgA 腎?。↖gA-nephropathy，IgAN）患者循環(huán) IgA-Fn（纖連蛋白）復(fù)合體水平增高，使 IgA 與Fn 在腎小球異常沉積進(jìn)而引起腎衰。CC10能夠競(jìng)爭(zhēng)性與存在于Fn 上的肝素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制 Fn-IgA 異聚化，降低 IgA 腎病患者循環(huán) IgA- Fn 復(fù)合體水平[51]。

4 與其他蛋白分子的相互作用

纖連蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成中起重要作用。rhCC10能夠通過(guò)轉(zhuǎn)谷酰胺酶（transglutaminase，TGase）共價(jià)結(jié)合人原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC）表面內(nèi)源和外源 Fn。在rhCC10 與Fn 相互作用的固相期，rhCC10 顯著抑制 HMVEC 對(duì) Fn的依附作用，而對(duì)其他胞外基質(zhì)蛋白沒(méi)有此作用。此外，體外研究表明 rhCC10 劑量依賴(lài)性抑制細(xì)胞遷移，阻止創(chuàng)傷愈合[52]。CC10能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞遷移入侵，研究顯示其能夠與HTB-81、HTB-30和HTB-174等腫瘤細(xì)胞株表面的脂鈣蛋白-1受體（Lip-1R）相互作用，發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和入侵的抑制作用[53]。

CC10能夠抑制 NF-кB 核轉(zhuǎn)位，抑制 NF-кB DNA結(jié)合活性及轉(zhuǎn)錄活性[54]。

5 作為疾病生物標(biāo)記

研究顯示 CC10 對(duì) ALI/ARDS 患者具有很好的診斷價(jià)值。血漿 CC10 水平快速增高 30% 或更高對(duì)診斷ALI/ARDS 有 90% 敏感性和92% 特異性，且CC10 水平在ALI/ARDS 診斷前 2 天增高，提示血漿 CC10 可作為呼吸機(jī)相關(guān)肺炎 ALI/ARDS 患者潛在的生物標(biāo)記[55]。與心源性肺水腫相比，CC10 水平在ALI/ARDS 患者血漿及肺部水腫液中明顯降低，在幫助鑒別診斷 ALI/ARDS和心源性肺水腫方面是有前景的生物標(biāo)記物[56]。哮喘兒童血清CC10 水平明顯降低，提示其可能作為兒童哮喘的有效診斷指標(biāo)[57]。Hasegawa等[58]研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化患者血清CC10 水平較系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常受試者高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CC10 水平增高與合并肺纖維化有關(guān)。操作性特征曲線(xiàn)分析顯示，CC10 水平增高對(duì)于檢測(cè)系統(tǒng)性硬化患者是否合并肺纖維化與SP-D 具有相同的意義。認(rèn)為CC10 水平可作為診斷系統(tǒng)性硬化患者合并肺纖維化的潛在血清標(biāo)記物。

6 展望

大量研究結(jié)果顯示 CC10 具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤活性，但是相關(guān)作用機(jī)制仍不明確。STRING8.3是已知和預(yù)測(cè)蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，目前整合了 630 種生物體近 2, 590, 259 種蛋白質(zhì)。STRING8.3 中相互作用分為直接（生理）和間接（功能）關(guān)聯(lián)，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)來(lái)源包括基因組、高通量實(shí)驗(yàn)、共表達(dá)以及先前知識(shí)。通過(guò) STRING8.3 數(shù)據(jù)庫(kù)分析（圖 1）表明：CC10 與CUBN、LRP2、LRPAP1等膜受體存在直接或間接關(guān)聯(lián)，與CEBPD、FOXA1、SPDEF、TFF3、FOXA2、TITF1、SFTP1、RB1等轉(zhuǎn)錄因子具有相關(guān)關(guān)系，與IL5、IL13等 Th2 細(xì)胞因子具有直接相關(guān)關(guān)系。推測(cè) CC10 可能通過(guò)膜受體將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子低表達(dá)相應(yīng)炎性介質(zhì)介導(dǎo)抗炎、抗腫瘤效應(yīng)。在今后的研究中，應(yīng)充分利用現(xiàn)代生物信息學(xué)、分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)深入研究 CC10 在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，明確相關(guān)分子相互作用關(guān)系，揭示相關(guān)生物信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

圖1 CC10 與其他蛋白相互關(guān)系圖

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