VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠燒傷皮膚組織中的表達

張愛群 孫富國 徐忠華 徐振轅 王昭英 陳錄庭

現(xiàn)代海戰(zhàn)中海水浸泡傷的發(fā)生率很高[1]。本研究采用流式細胞儀檢測海水浸泡大鼠皮膚燒傷組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）的表達，探討兩者在病變發(fā)展和恢復過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 實驗選用普通級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.681±8.194）g，隨機分成實驗組（海水浸泡）和對照組（生理鹽水浸泡）。每組又分為損傷后2 h和1、3、5、7、14 d 6個時點，每個時點5只大鼠。

1.2 模型制作 每組大鼠均以10%水合氯醛0.7～0.8 mL腹腔內(nèi)注射，麻醉后1～2 min即實施模型制作。鼠背部褪毛并用酒精燈藍色火焰燒灼局部皮膚7～8 s，造成深Ⅱ度燒傷（病理證實），面積約3 cm×3 cm×4 cm，然后將大鼠分別浸泡于海水或生理鹽水中，2 h后取出，大鼠可自由攝食和飲水。

1.3 標本采集 分別于浸泡后2 h和1、3、5、7、14 d脫頸處死，取燒傷處皮膚組織，70%乙醇固定，4℃冰箱封存約30 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 流式細胞儀及檢測參數(shù) 采用美國Beckman Coultet公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激光波長為488 nm。

1.4.2 主要試劑 美國圣克魯斯生物公司生產(chǎn)VEGF鼠抗人多克隆抗體（147）：SC-507；b-FGF鼠抗人多克隆抗體（147）：SC-79。

1.4.3 流式細胞懸液制備方法 將固定的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。將平皿中的混懸液經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液，以500～800 r/min離心沉淀2 min。

1.4.4 細胞免疫熒光標記 取單細胞懸液1×106/mL 0.1 mL，加入鼠抗人多克隆抗體工作液0.1 mL，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL洗滌1次，棄上清，加入羊抗鼠熒光素-IgG（FITC-IgG）二抗工作液100 μL，避光、室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL離心同上，棄上清以除去未結(jié)合的熒光抗體，上機檢測前加入二抗的陽性對照和陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示，同一時點組間比較采用兩獨立樣本資料t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2組大鼠皮膚燒傷組織傷后1～14 d，實驗組VGEF和b-FGF表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3 討論

VEGF與b-FGF是皮膚燒傷創(chuàng)面愈合過程中的2種重要細胞因子。對創(chuàng)面血管增生、肉芽組織形成、膠原纖維合成有重要作用。海水具有高滲、堿性、低溫、有菌等特點，可加重傷口局部及周圍組織的水腫、變性、壞死及炎性反應[2]。海水浸泡傷口，受海水高滲等理化因素的影響，使局部組織微環(huán)境及各種生長因子發(fā)生變化，導致VEGF與b-FGF升高，兩者與組織創(chuàng)傷的嚴重程度及愈合情況關(guān)系密切。

VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能細胞因子，廣泛表達于成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞等多種細胞，VEGF特異地與血管內(nèi)皮細胞上的專一受體血管內(nèi)皮生長因子受體Ⅰ（FLR-1）或血管內(nèi)皮生長因子受體Ⅱ（KDR）結(jié)合，從而引起內(nèi)皮細胞增殖及血管通透性增加，其主要功能是促進血管內(nèi)皮細胞分化增殖，增加微靜脈和小靜脈的通透性[3]，使血漿蛋白滲到血管外形成臨時基質(zhì)，利于血管形成[4]，在皮膚損傷愈合過程中起重要作用。正常皮膚有多種細胞因子表達，其中VEGF呈低水平表達，主要表達于基底細胞及血管內(nèi)皮細胞。VEGF的表達受低氧、活化癌基因、生長因子、細胞因子等多種因素的調(diào)控[5]，如b-FGF、腫瘤壞死因子（TNF）-α等均可促進VEGF的表達，間接發(fā)揮促血管形成的作用。本研究顯示VEGF自損傷后2 h開始升高，損傷后1～14 d實驗組高于對照組，損傷后5d達高峰，較對照組峰值錯后2 d，以后緩慢下降，但仍高于對照組。隨損傷創(chuàng)面的愈合，VEGF逐漸下降，實驗組明顯慢于對照組，VEGF在形成新生血管的同時，也加重組織細胞的脫水，使血栓形成的危險增加。b-FGF即堿性成纖維細胞生長因子，可誘導多種細胞增殖、分化，與創(chuàng)傷愈合密不可分。b-FGF可促進VEGF的生成，發(fā)揮促血管生成作用，且具有絲裂原活性，可促進成纖維細胞的生長、增殖，其還具有趨化作用，趨化炎性細胞和組織修復細胞向創(chuàng)面聚集[6]。b-FGF主要存在于表皮細胞、內(nèi)皮細胞和部分成纖維細胞的胞漿和胞外基質(zhì)中。對傷口肉芽組織形成、局部血管增生、膠原纖維合成有重要作用，與海水浸泡傷情嚴重程度有關(guān)。

表1 VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚織中不同時間的表達 （n=5，±s）

表1 VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚織中不同時間的表達 （n=5，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01

指標 組別VEGF b-FGF對照組實驗組t對照組實驗組t 2 h 320.42±40.51 338.89±52.97 0.619 338.38±26.56 395.76±98.17 1.262 1 d 332.05±40.23 397.99±33.16 2.828*389.71±41.38 490.64±66.76 2.874*損傷后時間3 d 414.07±65.19 492.27±34.01 2.378*434.04±29.75 522.66±31.52 4.572**5 d 411.33±33.44 529.49±41.16 4.982**441.20±21.54 534.05±33.90 5.170**7 d 405.44±52.00 498.38±49.09 2.906*434.04±35.56 569.39±53.51 4.711**14 d 349.89±38.20 421.18±49.49 2.550*411.24±19.89 483.68±53.76 2.826*

VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚燒傷局部組織表達增高，與細胞缺血、缺氧、損傷程度及范圍有密切關(guān)系，對判斷海水浸泡傷情及預后具有一定參考價值，臨床救治過程中應密切注意血液濃縮等情況的改變，防止血栓形成的發(fā)生。

[1]沈宏亮,王強,錢方,等.左氧氟沙星殼聚糖緩釋微球?qū)Ｋ輨?chuàng)傷的初期治療效果[J].外科理論與實踐,2006,31（3）:262-264.

[2]蔣建新,王正國,尹志勇.戰(zhàn)創(chuàng)傷研究進展[J].人民軍醫(yī),2007,50（1）:22-24.

[3]李菲菲,米立國,隋鴻錦.血管內(nèi)皮生長因子對皮膚血管生成影響的研究進展[J].大連醫(yī)科大學學報，2009,31（5）：599-603.

[4]劉霞,高峰.創(chuàng)傷愈合的分子機制研究進展[J].醫(yī)學綜述，2005，11（3）:199-202.

[5]毛光華，韓存芝，張俊萍，等.血清中VEGF，VEGFR1與VEGFR2在肺癌中的表達及其相互關(guān)系[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2009,3（22）：1-2.