不同添加劑對(duì)小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)

司紅起 馮繼明 盧 杰 馬傳喜

不同添加劑對(duì)小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)

司紅起 馮繼明 盧 杰 馬傳喜

(農(nóng)業(yè)部安徽省小麥區(qū)域技術(shù)創(chuàng)新中心安徽小麥產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心省部共建分子植物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，合肥 230036)

通過(guò)測(cè)定76個(gè)小麥品種全麥粉中多酚氧化酶(PPO)在6種化學(xué)試劑作用下的酶活性變化情況，比較了這6種化學(xué)試劑對(duì)PPO的抑制和激活效應(yīng)，同時(shí)分析了添加劑濃度和基因型對(duì)抑制激活效應(yīng)的影響。結(jié)果表明:小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)同時(shí)受添加劑種類、添加劑濃度和基因型影響;亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對(duì)小麥PPO產(chǎn)生抑制效應(yīng)，蔗糖和低濃度檸檬酸產(chǎn)生激活效應(yīng)，而高濃度檸檬酸產(chǎn)生抑制效應(yīng)，亞硫酸氫鈉的抑制效應(yīng)比維生素C和谷胱甘肽強(qiáng);維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉的添加濃度與PPO活性呈對(duì)數(shù)關(guān)系;谷胱甘肽和維生素C可考慮作為抑制小麥PPO活性的食品添加劑。

小麥 多酚氧化酶 添加劑 抑制劑 褐變 色澤

多酚氧化酶(PolyPhenol Oxidase，PPO)又叫酪氨酸酶、兒茶酚酶、酚酶、氯原酸酶等，因其能結(jié)合Cu2+，故又稱金屬蛋白。其主要參與酶促褐變反應(yīng)而生成有色物質(zhì)，造成植物經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低，同時(shí)還可能與植物的應(yīng)激免疫反應(yīng)有關(guān)，如感染病蟲害、早熟、早衰和機(jī)械損傷都能誘導(dǎo)多酚氧化酶活性的上升。多酚氧化酶廣泛存在于植物界中。目前對(duì)小麥PPO的研究主要集中在 PPO活性檢測(cè)［1－3］、PPO與鮮面片和小麥粉色澤的關(guān)系［4－7］、PPO 分子標(biāo)記及其基因克隆定位［8－11］等方面，在小麥 PPO活性控制方面研究相對(duì)較少［12－15］。由于PPO活性高是導(dǎo)致小麥粉和面團(tuán)褐變的主要原因［4－7］，所以對(duì)小麥PPO活性進(jìn)行控制已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一［12－15］。司紅起等［16－17］研究了氯化銅、銅試劑、巰基乙醇、EDTA、飽和NaCl和SDS對(duì)小麥PPO活性的影響，指出銅試劑、巰基乙醇和EDTA能較好地抑制小麥PPO活性。本研究以遺傳多樣性極其豐富的微核心種質(zhì)為試材又分析了檸檬酸、維生素C、蔗糖、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑對(duì)小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)，旨在尋求一個(gè)能有效控制小麥PPO活性、防止小麥粉和面團(tuán)褐變、提高小麥粉和食品加工品質(zhì)的有效方法，進(jìn)而為今后小麥粉及食品加工、小麥品質(zhì)育種及尋求無(wú)毒害食品添加劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料和設(shè)備

選取76份小麥微核心種質(zhì)作為供試材料，2006年收獲于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)內(nèi)。

UV755B分光光度計(jì):上海精科實(shí)業(yè)有限公司;3K30冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma公司;Cyclotec 1093樣品磨:丹麥FOSS公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 全麥粉的制備

采用帶0．5 mm篩的1093樣品磨對(duì)上述76個(gè)小麥品種進(jìn)行磨粉處理。

1．2．2 小麥PPO活性檢測(cè)

參考AACC 22－85進(jìn)行測(cè)定。稱取0．300 0 g全麥粉樣品放入約50 mL小燒杯中，加入7．5 mL反應(yīng)試劑(pH 6．0的磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液，10 mmol/L鄰苯二酚)，恒溫水浴振蕩器上振蕩5 min。振蕩器速度設(shè)為100 r/min，溫度設(shè)為37℃。迅速將反應(yīng)后的樣品放在冰塊上終止反應(yīng)(3 min)。終止反應(yīng)的樣品迅速混勻，4℃下10 000×g離心5 min。以反應(yīng)試劑(鄰苯二酚+緩沖液)為對(duì)照，在410 nm下測(cè)定上清液的吸光度ΔA(ΔA為5 min內(nèi)吸光值的變化)。PPO活性計(jì)算公式為:PPO活性=103×ΔA值/5/0．3(每克全麥粉中 PPO的含量，用410 nm下每分鐘吸光度改變量的1 000倍來(lái)表示)，單位為UA410。

1．2．3 添加劑存在條件下小麥PPO活性檢測(cè)

稱取0．300 0 g全麥粉樣品放入約50 mL小燒杯中，加入7．5 mL反應(yīng)試劑(pH 6．0的磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液，10 mmol/L鄰苯二酚)，同時(shí)加入添加劑(檸檬酸、維生素C、蔗糖、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑，緩沖液配制)至終濃度分別為0．1、0．2、0．4、0．6、0．8 mmol/L，其余操作按1．2．2 程序進(jìn)行。以反應(yīng)試劑(鄰苯二酚+緩沖液)+添加劑(終濃度保持一致)為對(duì)照，在410 nm下測(cè)定上清液的吸光度ΔA(ΔA為5 min內(nèi)吸光值的變化)。PPO活性計(jì)算及單位同 1．2．2。

2 結(jié)果與分析

2．1 添加劑對(duì)小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)

2．1．1 抑制(激活)倍數(shù)與抑制(激活)百分率

抑制(激活)倍數(shù)為加入添加劑后，PPO活性凈減少(增加)部分與未加入添加劑PPO活性的比值;最大抑制(激活)倍數(shù)指，在同一添加劑濃度下，不同小麥品種中，數(shù)值最大的抑制(激活)倍數(shù);平均抑制(激活)倍數(shù)指，在同一添加劑濃度下，所有小麥品種PPO活性抑制(激活)倍數(shù)的平均值;抑制(激活)百分率指，所有76份小麥品種中，其PPO活性被抑制(激活)的品種數(shù)占品種總數(shù)的百分比。本研究發(fā)現(xiàn):最大抑制(激活)倍數(shù)受基因型的影響較大，而平均抑制(激活)倍數(shù)和抑制(激活)百分率受品種數(shù)目影響較大。從表1可以看出，亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對(duì)小麥PPO產(chǎn)生抑制效應(yīng)，蔗糖和低濃度檸檬酸產(chǎn)生激活效應(yīng)(激活效應(yīng)不明顯)，而高濃度檸檬酸產(chǎn)生抑制效應(yīng)(抑制效應(yīng)不明顯)。亞硫酸氫鈉在0．1～0．8 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)所有76個(gè)小麥品種PPO均產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，說(shuō)明亞硫酸氫鈉是一種PPO活性抑制效果較好的添加劑，但要注意添加量。亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和維生素C對(duì)PPO的平均抑制倍數(shù)隨濃度的增加而增大，說(shuō)明濃度越高對(duì)PPO的抑制效果越好。銅試劑在0．4 mmol/L時(shí)對(duì)PPO的平均抑制倍數(shù)達(dá)到最大，隨濃度增加先減小后增大。

表1 抑制、激活倍數(shù)及抑制、激活百分率

2．1．2 添加劑對(duì)小麥PPO活性的影響

從圖1可以看出:檸檬酸和蔗糖對(duì)小麥PPO活性影響較小，前者在0．1～0．4 mmol/L以及后者在0．1～0．8 mmol/L范圍內(nèi)起激活效應(yīng)，前者在0．6～0．8 mmol/L范圍內(nèi)起抑制效應(yīng)，二者的抑制和激活效應(yīng)均不明顯。維生素C、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑這四種添加劑對(duì)小麥PPO活性影響較大，均起抑制效應(yīng)，且抑制效應(yīng)十分明顯。

圖1 6種添加劑對(duì)小麥PPO活性的影響

2．2 添加劑濃度對(duì)抑制和激活效應(yīng)的影響

由圖1可知，檸檬酸和蔗糖的添加濃度對(duì)抑制、激活效應(yīng)影響不明顯。由表1可知，添加檸檬酸和蔗糖后，PPO活性在原始活性上下浮動(dòng)，浮動(dòng)幅度最大不超過(guò)4%。維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉這四種添加劑隨著添加濃度的增大，PPO活性明顯降低，降低趨勢(shì)與添加劑濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系，它們之間的對(duì)數(shù)關(guān)系式分別是:y1= －73．586ln(x1)+213．07，y2=－72．099ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4= －76．793ln(x4)+198．38，能分別解釋添加劑濃度和PPO活性之間關(guān)系的86%，85%，75%，97%，且達(dá)極顯著水平，如圖2所示。維生素C和谷胱甘肽這兩種添加劑對(duì)小麥PPO活性的抑制效果基本一致，而亞硫酸氫鈉的抑制效果則比前兩者強(qiáng)。銅試劑在0．4 mmol/L時(shí)對(duì)小麥PPO活性的抑制效果明顯比其他濃度時(shí)的抑制效果好。

圖2 添加劑濃度與PPO活性的關(guān)系

2．3 基因型對(duì)抑制和激活效應(yīng)的影響

相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)為添加劑存在條件下的酶活力單位與無(wú)抑制劑條件下的酶活力單位之比。相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)大于1，說(shuō)明相應(yīng)的添加劑對(duì)PPO起激活效應(yīng);相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)小于1，說(shuō)明相應(yīng)的添加劑對(duì)PPO起抑制效應(yīng)。相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)越大，其對(duì)PPO活性抑制效果越差，相反，相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)越小，其對(duì)PPO活性的抑制效果則越好。

以亞硫酸氫鈉為例(圖3)，不同的品種在同一濃度亞硫酸氫鈉作用下，其相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)也不同，相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)變化較大，說(shuō)明基因型對(duì)抑制效應(yīng)影響明顯，其原因可能是PPO種類不同，控制合成PPO的基因不同，即存在一個(gè)質(zhì)的問(wèn)題;同一品種在不同濃度亞硫酸氫鈉作用下，其相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)也不同，多數(shù)品種相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)變化較大，少數(shù)品種相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)變化較小，可能是因?yàn)槠贩N不同，其所含PPO的量也不同，即存在一個(gè)量的問(wèn)題。同一品種在不同添加劑作用下，其相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)不同;不同品種在相同添加劑作用下，其相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)也不同;檸檬酸和蔗糖作用下的76個(gè)品種的PPO相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)在1．0上下浮動(dòng)，而維生素C、谷胱甘肽和亞硫酸氫鈉作用下的76個(gè)品種的PPO相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)在0．5上下浮動(dòng)(圖4)。圖3、圖4說(shuō)明抑制和激活效應(yīng)均受基因型的影響，影響程度因基因型而異。

3 結(jié)論

小麥粉中PPO是引起面制食品產(chǎn)生褐變的重要因素之一，通過(guò)添加劑來(lái)控制PPO活性是方便、快捷而又十分有效的方法。

3．1 亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對(duì)小麥PPO產(chǎn)生抑制效應(yīng)，蔗糖和低濃度檸檬酸產(chǎn)生激活效應(yīng)(激活效應(yīng)不明顯)，而高濃度檸檬酸產(chǎn)生抑制效應(yīng)(抑制效應(yīng)不明顯)。維生素C和谷胱甘肽這兩種添加劑對(duì)小麥PPO活性的抑制效果基本一致，而亞硫酸氫鈉的抑制效果則比前兩者強(qiáng)。

3．2 維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉的添加濃度與PPO活性呈對(duì)數(shù)關(guān)系，其對(duì)數(shù)關(guān)系式分別為:y1= － 73．586ln(x1)+213．07，y2= － 72．099 ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4=－76．793ln(x4)+198．38，能分別解釋添加劑濃度和PPO活性之間關(guān)系的86%，85%，75%，97%，且達(dá)極顯著水平。

3．3 亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C是較理想的小麥PPO活性抑制劑，而谷胱甘肽和維生素C可

考慮作為抑制小麥PPO活性的“綠色”“食品添加劑。3．4 小麥PPO的抑制和激活效應(yīng)同時(shí)受添加劑種類、添加劑濃度和基因型影響。

［1］楊朝柱，馬傳喜，司紅起，等．普通小麥品種多酚氧化酶活性的變異［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(11):1713－1717

［2］陸成彬，程順和，張伯橋，等．基因型和地點(diǎn)對(duì)小麥品種面粉多酚氧化酶活性的影響研究［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(1):13－16

［3］司紅起，馬傳喜，何克勤，等．小麥多酚氧化酶活性檢測(cè)方法的比較分析［J］．糧食與飼料工業(yè)，2007(7):8－10

［4］胡瑞波，田紀(jì)春．鮮切面條色澤影響因素的研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19(6):18 －22

［5］華為，馬傳喜，何中虎，等．小麥鮮面片色澤的影響因素研究［J］．麥類作物學(xué)報(bào)，2007，27(5):816 －819

［6］葛秀秀，何中虎，楊金，等．我國(guó)冬小麥品種多酚氧化酶活性的遺傳變異及其與品質(zhì)性狀的相關(guān)分析［J］．作物學(xué)報(bào)，2003，29(4):481 －485

［7］蘭靜，王樂(lè)凱，張守文，等．影響面粉色澤因素的研究［J］．麥類作物學(xué)報(bào)，2004，24(4):75 －79

［8］Sun D J，He Z H，Xia X C，et al．A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat［J］．Molecular Breeding，2005，16:209 －218

［9］He X Y，He Z H，Zhang L P，et al．Allelic variation of polyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat［J］．Theor Appl Genet，2007，115:47 － 58

［10］He X Y，He ZH，Morris CF，et al．Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxidase genes in common wheat and related species［J］．Genet Resour Crop Evol，2009，56:311 －321

［11］Wang X B，Ma C H，Si H Q，et al．Gene markers for grain polyphenol oxidase activity in common wheat［J］．Mol Breeding，2009，23:163 －170

［12］張曉，田紀(jì)春，胡瑞波．SDS對(duì)小麥多酚氧化酶提取效率及激活效應(yīng)影響的研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23(1):26－31

［13］司紅起，馬傳喜，余亮．檸檬酸對(duì)小麥多酚氧化酶活性的影響［J］．糧食與飼料工業(yè)，2008(10):7－8

［14］黃海霞，張真，吳金芝．小麥多酚氧化酶特性及褐變控制研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(31):13574 －13575，13638

［15］常成，張海萍，尤明山，等．抗壞血酸對(duì)小麥多酚氧化酶活性抑制的研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22(1):14 －18

［16］司紅起，馬傳喜，夏云祥，等．酶活抑制劑對(duì)小麥PPO活性的影響［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21(4):35－39

［17］司紅起，馬傳喜，董召榮，等．小麥多酚氧化酶抑制和激活效應(yīng)的研究［J］．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(2):195 －198．

Inhibition and Activation Effects of Different Additives on Wheat PPO Activity

Si Hongqi Feng Jiming Lu Jie Ma Chuanxi
(Anhui Provincial Wheat Area Tech－nology Innovation Centre of Ministry of Agriculture Wheat Industry Engineering Tech－nology Research Centre of Anhui Province Key Laboratory of Plant Molecular Breeding of Ministry of Education School of Agronomy of Anhui Agricultural University，Hefei 230036)

Seventy － six wheat cultivars were selected as the experimental materials，and polyphenol oxidase(PPO)was extracted by citric acid － phosphate buffer from their whole wheat flour．Six chemical reagents selected as PPOinhibitors and activators were put into the enzymical extract，and then PPO activity was determined using spectrophotometer．The results showed that:the inhibition and activation were influenced by kinds，concentration of additives and wheat cultivars;sodium hydrogen sulfite，sodium diethyldithiocarbamate，glutathione and vitamin C had the inhibition on wheat PPO，and the sucrose and lower concentration citric acid had unobvious activation．However，higher concentration citric acid had unobvious inhibition and the inhibition of sodium hydrogen sulfite was stronger than vitamin C and glutathione;it was presented for logarithmic relationship between wheat PPO activities and concentrations of vitamin C，glutathione，sodium diethyldithiocarbamate and sodium hydrogen sulfite;Glutathione and vitamin C could be used as the food additives to inhibit wheat PPO activity．

wheat，polyphenol oxidase，additive，inhibitor，browning，color

S512．1

A

1003－0174(2011)07－0006－04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2009BADA6B01)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)，安徽省良種優(yōu)質(zhì)化專項(xiàng)(08010 301065)，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金(wd2008－10)

2010－08－18

司紅起，男，1972年出生，副教授，小麥品質(zhì)改良及分子育種

馬傳喜，男，1963年出生，教授，小麥品質(zhì)改良及分子育種