擬穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表達(dá)及抑菌活性分析

徐棟梁，李潔穎，彭永鶴，夏立新*，劉志剛*

(1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東深圳 518060；2.深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518057)

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)顯示出良好的應(yīng)用與發(fā)展前景.抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子肽，廣泛存在于各類(lèi)動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]，研究表明，抗菌肽不僅具有廣譜抗各種革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的活性，而且具有抗病毒、原生動(dòng)物和腫瘤細(xì)胞等作用[3].

自1993年美國(guó)學(xué)者D.P.CLARK等首次從牛蛙皮膚內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗菌肽Ranalexin后[4]，國(guó)外學(xué)者對(duì)其做了深入研究，尤其是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌有較好的抗菌活性[5]，抗菌肽天然資源有限，分離提取有一定困難，合成抗菌肽的成本高.基因工程表達(dá)成為大量生產(chǎn)的首選解決方案.

無(wú)脊椎動(dòng)物體液中沒(méi)有免疫球蛋白，缺乏抗體介導(dǎo)的特異性免疫系統(tǒng)，依賴(lài)先天性非特異性免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除入侵的微生物維持機(jī)體健康.抗菌肽是蟹類(lèi)的先天免疫因子之一，作為低御外源微生物入侵的第一道防線(xiàn).研究蟹類(lèi)動(dòng)物非特異性免疫機(jī)理可作為蟹類(lèi)養(yǎng)殖疾病防治提供理論依據(jù)和新的思路.目前，對(duì)擬穴青蟹的研究主要集中在線(xiàn)粒體COI基因序列的分析[6]、ISSR-PCR條件的優(yōu)化[7]及DNA的優(yōu)質(zhì)提取方面[8]，還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于擬穴青蟹抗菌肽蛋白的研究報(bào)道.本研究利用E.coliOrigamiTM(DE3)成功獲得了含擬穴青蟹Crustin基因(簡(jiǎn)稱(chēng)CrusSp)的重組大腸桿菌菌株，轉(zhuǎn)化E.coliOrigamiTM(DE3)中表達(dá)了CrusSp蛋白,研究了CrusSp蛋白的抗真菌和細(xì)菌的生物活性，為進(jìn)一步探討其抗菌感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟹和菌種 擬穴青蟹(ScyllaParamamosain)購(gòu)于深圳南澳海鮮街.金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CMCC 26003)、大腸埃希氏菌Escherichiacoli(CMCC 44825)、短小芽孢桿菌Brevibacillusbrevis(CICC 9003)、白色念珠菌Candidiasisalbicans(AS 2.2086)、黑曲霉Aspergillusniger(AS 3.3928)、白地霉Geotrichumcandidum(CICC 1315)、產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum(AS 3.3890)和綠色木霉Trichodermaviride(AS 3.2942)購(gòu)于廣州市微生物研究所.

1.1.2 主要試劑 提取總RNA和RT-PCR試劑盒購(gòu)自Qiagen公司,原核表達(dá)載體E.coliOrigamiTM(DE3)購(gòu)自Invitrogen公司.pMD18-T載體、Ex-Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamHI及HindIII、T4 DNA連接酶和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司.Ni-NTA matrix 及柱子購(gòu)自Amersham Pharmacia 公司.NA培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基購(gòu)于廣州微生物研究所.

1.2 擬穴青蟹CrusSp編碼基因的獲得

從SWISS-PROT、TrEMBL、以及NCBI中搜尋蟹常見(jiàn)的Crustin基因，利用Clustal W程序?qū)@些序列進(jìn)行同源性比較，確定其保守區(qū)域并設(shè)計(jì)兼并引物(由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成)：

Crab5j 5’tcccgagtacctccatatctagg 3’ Crab3j 5’ ttagtagaattcaacagtcttgcatac3’

從擬穴青蟹血細(xì)胞中提取總RNA,進(jìn)行RT-PCR, 通過(guò)5’-RACE和3’-RACE確定編碼多肽的基因序列，克隆擬穴青蟹中抗菌肽的相似基因.將獲得的擬穴青蟹抗菌肽編碼基因片段連結(jié)于克隆質(zhì)粒pMD18-T載體上，用氯化鈣法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliTop10克隆菌中，通過(guò)含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗氨芐篩選，挑取陽(yáng)性菌落(含重組質(zhì)粒)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證.挑取陽(yáng)性菌落入LB培養(yǎng)基搖菌，提取質(zhì)粒酶切電泳后送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定.

1.3 序列分析

將測(cè)序所得序列通過(guò)GeneBank進(jìn)行序列比對(duì)，推導(dǎo)其相應(yīng)氨基酸序列，對(duì)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量利用在線(xiàn)程序Compute pI/Mw tool(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)進(jìn)行評(píng)估.

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

為了將擬穴青蟹CrusSpcDNA片段連入pET-32a(+)表達(dá)載體，在其cDNA片段的5’和3’末端通過(guò)PCR反應(yīng)分別引入BamHI及HindIII酶切位點(diǎn)，PCR引物序列如下：

Crab5t 5’ggatcctcccgagtacctccata3’ Crab3t 5’aagcttttagtagaattcaacagtctt3’

回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，菌落經(jīng)PCR及BamHI和HindIII酶切鑒定.測(cè)序后，將帶有目的基因的克隆質(zhì)粒用BamHI及HindIII雙酶切，然后按常規(guī)方法連結(jié)于經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒.以重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,菌落PCR鑒定，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆后經(jīng)測(cè)序鑒定.

1.5 重組CrusSp蛋白的表達(dá)和純化

挑取陽(yáng)性菌落入LB培養(yǎng)基搖菌，提取質(zhì)粒，行菌落PCR、酶切電泳及送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定與原序列一致.

在條件為28 ℃、菌液OD600達(dá)到0.6時(shí)加入濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，分別取誘導(dǎo)時(shí)間為0、2、4、6、8 h的菌體進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間.超聲破碎菌體后分別取上清和沉淀進(jìn)行可溶性分析，Ni2+親和層析柱純化，10 mM Tris-HCI(pH 7.4)透析處理純化的蛋白，15% SDS-PAGE 電泳，冷凍干燥后-80 ℃保存.

1.6 重組CrusSp蛋白的活力測(cè)定

將冷凍保存的蛋白用10 mM Tris-HCI(pH 7.4)溶解并BCA法定量，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、短小芽孢桿菌和白色念珠菌)(CFU=1.5×106個(gè)/mL)以1∶200比例均勻涂布于NA培養(yǎng)基瓊脂平板上，待干燥后貼上無(wú)菌濾紙片(6.0 mm),將質(zhì)量濃度為30 mg/mL和15 mg/mL的CrusSp蛋白溶液20 μL 加到無(wú)菌濾紙片上，以10 mM Tris-HCI(pH 7.4)為陰性對(duì)照，同時(shí)以含氨芐青霉素的藥敏紙片為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃孵育12 h后觀察抑菌效果.

將白地霉、黑曲霉、綠色木霉和產(chǎn)黃青霉點(diǎn)種于PDA瓊脂培養(yǎng)平板中央，待菌落生長(zhǎng)到合適大小，將無(wú)菌濾紙片放到距離菌落邊緣0.5 cm 處.將質(zhì)量濃度分別為30、15 mg/mL的CrusSp蛋白溶液20 uL加到無(wú)菌濾紙片上，以10 mM Tris-HCI(pH 7.4)為陰性對(duì)照，同時(shí)以含氨芐青霉素的藥敏紙片為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃孵育72 h后觀察抑菌效果.

2 結(jié)果

2.1 擬穴青蟹CrusSp基因的克隆

提取的擬穴青蟹總RNA通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在273 bp左右有一亮帶(圖1).回收RT-PCR產(chǎn)物并與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliTop10.挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖2)，陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序.

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 RT-PCR amplification of CrusSp gene

M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：PCR得到的蟹CrusSp基因片段

圖2 菌落PCR鑒定Figure 2 Colony PCR identification

1-3：擬穴青蟹CrusSpcDNA陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定;M:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)

2.2 序列分析

克隆得到的CrusSp成熟肽基因由273個(gè)堿基組成(含終止密碼子)，推導(dǎo)的核酸序列編碼90個(gè)氨基酸(圖3).經(jīng)計(jì)算分析，推測(cè)該蛋白的分子質(zhì)量為110.27 ku,等電點(diǎn)為8.54.

圖3 擬穴青蟹CrusSp成熟肽核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the CrusSp

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

提取陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行BamHI及HindIII雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳分析(圖4).插入的CrusSP片段的大小與預(yù)期一致.陽(yáng)性克隆的DNA序列測(cè)定結(jié)果顯示插入的片段準(zhǔn)確無(wú)誤.

2.4 擬穴青蟹CrusSp蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coliOrigamiTM(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).28 ℃經(jīng)0.1 mmol/L 的IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，分別取0、2、4、6、8 h的誘導(dǎo)菌行15% SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色顯示在分子質(zhì)量30.7 ku左右處有外源蛋白表達(dá)條帶出現(xiàn)(空載體pET-32a表達(dá)的蛋白分子質(zhì)量的理論值為20.4 ku)，蛋白分子質(zhì)量與預(yù)期結(jié)果相符(圖5).超聲破碎菌體后分別取上清液和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白主要分布在上清液中.將菌體裂解后的上清液采用Ni2+親和層析柱進(jìn)行了純化，依次用6倍柱床體積的洗脫緩沖液(60、100、250、500 mmol/L 咪唑,0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9)進(jìn)行洗脫,經(jīng)15% SDS-PAGE檢測(cè)(圖6)為純化蛋白，經(jīng)冷凍干燥成粉末后- 80 ℃ 保存.

2.5 重組擬穴青蟹CrusSp蛋白的活力測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果表明，重組擬穴青蟹CrusSp蛋白對(duì)綠色木霉有明顯的抑菌活性(圖7)，對(duì)白地霉、黑曲霉和產(chǎn)黃青霉沒(méi)有抑菌活性(表1).

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒的BamH I/Hind III雙酶切鑒定Figure 4 Enzyme digestion of the recombinant expression plasmids with BamH I and Hind III

1-4: 擬穴青蟹CrusSp 重組表達(dá)載體陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定;M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)

圖5 擬穴青蟹CrusSp蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Figure 5 Expression of recombinant protein from Scylla paramamosain

Lane M: Protein standard makers;Lane 0: Expression of recombinant protein before induction;Lanes 2，4，6，8: Expression of recombinant protein after 2, 4, 6 and 8 hours

圖6 擬穴青蟹CrusSp蛋白的可溶性分析及純化Figure 6 The solubility analysis and purification of fusion protein

M:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1:未加IPTG誘導(dǎo)的菌體;2：誘導(dǎo)后菌體超聲破碎上清液;3：菌體超聲破碎后沉淀;4：穿透峰;5-8：(60 、100、250、500 mmol/L 咪唑);0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9洗脫蛋白

圖7 擬穴青蟹CrusSp蛋白對(duì)綠色木霉的抑菌活性檢測(cè)Figure 7 Effect of CrusSp on the growth of Trichoderma viride.

A: 20μL 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer as control;B: 20 μL 10 mg/mL Amp as positive control;C: 600 μg CrusSp in 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer;D: 300 μg CrusSp in 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer.

表1 擬穴表蟹CrusSp蛋白抑菌活性測(cè)定Table 1 Antimicrobial activity of CrusSp

3 討論

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致越來(lái)越多的耐藥菌出現(xiàn)，因此抗菌肽的研究具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值.抗菌肽是由生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類(lèi)小分子多肽，其生成和釋放時(shí)機(jī)體炎癥反應(yīng)的組成部分，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障.抗菌肽具有分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定、強(qiáng)堿性和廣譜抗菌等特點(diǎn)[9].繼1975年瑞典科學(xué)家G.BOMAN等[10]人發(fā)現(xiàn)抗菌肽天蠶素以來(lái)，抗菌肽的研究已深入到分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制等多個(gè)方面.

由于抗菌肽具有分子質(zhì)量小、在生物體內(nèi)含量低、從生物體內(nèi)分離困難等缺點(diǎn)，因此運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)抗菌肽進(jìn)行重組表達(dá)成為大量生產(chǎn)的重要方式.本文通過(guò)搜尋蟹常見(jiàn)的Crustin基因，設(shè)計(jì)擬穴青蟹CrusSp基因的兼并性引物，從擬穴青蟹血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增編碼CrusSp成熟肽的cDNA序列，將其克隆至pMD18-T載體進(jìn)行擴(kuò)增，然后克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至E.coliOrigamiTM(DE3)中表達(dá)CrusSp蛋白，通過(guò)Ni2+親和層析柱純化獲得CrusSp蛋白，采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)對(duì)綠色木霉有抗菌活性，但對(duì)其它測(cè)試菌株沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌活性，可能是構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒蛋白帶尾片段影響Crustin的構(gòu)象.研究清除在以后的試驗(yàn)中需要標(biāo)簽，以獲得活性更大的Crustin蛋白.

本研究?jī)H對(duì)從擬穴青蟹克隆的抗菌肽的體外抗菌活性進(jìn)行了鑒定，關(guān)于其體內(nèi)的活性還有待證實(shí).隨著人們對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能的研究，通過(guò)對(duì)相關(guān)抗菌肽基因進(jìn)行有目的的加工修飾，可以改造并合成穩(wěn)定、高效、特異且對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害的抗菌肽基因，并通過(guò)基因工程菌進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn).盡管目前還有很多問(wèn)題沒(méi)有解決，但隨著研究的逐步深入，水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽將會(huì)對(duì)水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到重要的作用.

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